论文摘要
本研究使用测序菌株作阳性对照,药敏质控菌ATCC25922抽提的DNA作阴性对照,建立了动物源细菌对四环素类药物耐药基因三重PCR检测方法。同时,针对Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物等组份用量及退火温度、循环次数等循环参数进行优化并组装试剂盒。优化结果如下:10×PCR Buffer 5μL,浓度为25mM/LMgCl23.0μL,浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μL,浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.35μL,浓度均为25mmol/L三种耐药基因即tetA基因、tetC基因和tetM基因的特异性上下游引物（25 mmol/L）分别1.0μL、0.3μL、0.4μL。将其置于一无菌的PCR反应薄壁管中,加入已制备好的模板5μL,补水至总体积50μL后加入20μL矿物油封顶即可。经过反复实验对试剂盒的反应条件进行优化,最优PCR扩增循环参数为:94℃预变性5min;然后进入循环:94℃变性60s、56℃退火60s、72℃延伸60s,共35个循环,最后72℃延伸10min后,电泳观察结果。应用本检测试剂盒和传统药敏试验方法（K—B法）对100株细菌的耐药基因型和表型同时进行检测,并比较两者检测过程和检测结果。结果表明,细菌对四环素的耐药率最高为:92%（92/100）,对多西环素的耐药率次之,为:84%（84/100）,对米诺环素耐药率相对最低,为:75%（75/100）。在100株待检细菌中,tetA基因的检出率为46%（46/100）,tetC基因的检出率为:38%（38/100）,tetM基因的检出率为:33%（33/100）。两种方法检出结果的符合率为89%。比较常规的耐药基因检测方法:单重PCR方法与试剂盒采用的三重PCR方法,检测结果符合率为100%。在此基础上,对试剂盒特异性、敏感性、重复性和保质期等进行了系统的检测试验。检测结果表明:本试剂盒具有极强的特异性,只能特异性扩增出目的耐药基因。本试剂盒具有很高的灵敏度（4.0×104cfu/mL）;并且性能稳定,显示出了很好的批内和批间重复性（100%）。试剂盒在—20℃下的保质期为6个月。利用研制的试剂盒,对我国24个省的样品进行了耐药性检测。结果显示,不同种属的动物源细菌、不同来源动物,不同年代大肠杆菌四环素类药物耐药基因分布存在很大的差异。从70年代到今天,不同年代大肠杆菌tet基因的检出率呈明显上升的趋势。本研究率先在国内外建立了动物源细菌四环素类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒,并进行了初步应用,这在国内外均未见报导。本研究成果为动物源细菌四环素类耐药基因的检测提供了一种快速、经济、准确的方法。