钩端螺旋体Homoserine O-acetyltransferase结构解析与催化机理研究，人的Coactosin-like Protein结构解析

论文摘要

LiHTA—高丝氨酸氧乙酰转移酶（Homoserinc O-acetyltransferase，HTA，EC2．3．1．31）是在微生物和植物体内甲硫氨酸的生物合成途径中的第一个酶。它催化乙酰辅酶A的乙酰基转移到高丝氨酸上，这是一个两步的乒乓反应机制。我们用硒的单波长反常衍射的方法解析了来源于Leptospira interrogans——一种强致病性的钩端螺旋体——的HTA的分辨率为2.2（?）的晶体结构。HTA结构是由两个独立的结构域组成，一个核心的a／β结构域，包含有催化位点，另一个是由a螺旋束构成的Lid结构域。整体上来说，这种折叠方式属于a／β水解酶超家族，特征是该家族的活性位点的催化三联体位于结构的特定loop上。我们的精细结构发现催化三联体的组氨酸和丝氨酸都是处于两种构象，并且与催化相关的残基的构象很多具有较大的柔性。根据我们的结果我们给出了一个更为精细的推测的反应机理，其中组氨酸双构象起到了决定性的作用。 hCLP—人的肌动蛋白辅助蛋白类似蛋白（Human coactosin-like protein，hCLP）是一种肌动蛋白丝的结合蛋白，它与肌动蛋白单体没有结合作用。它与5—磷脂酶无论在体外还是体内都有结合作用，在调节肌动蛋白和5—磷脂酶的活性方面起到了重要的作用。帽子蛋白阻碍肌动蛋白的多聚，而肌动蛋白辅助蛋白可以阻碍帽子蛋白的活性，但是肌动蛋白辅助蛋白本身对肌动蛋白的聚合或者解聚都没有任何影响。我们用硒的多波长反常衍射的方法解析了hCLP的晶体结构。该结构表明它与ADF—H结构域有着高度的结构相似性，尽管一级序列同源性非常低。我们发现一些保守的疏水残基很可能对这种折叠同源性有重要贡献。该结构表明CLP以一种非常不同于ADF／Cofilin家族的方式与肌动蛋白丝结合。结合之前的突变研究，我们分别分析了CLP与肌动蛋白丝和5—磷脂酶的结合位点。这两个结合位点在空间上非常的接近，很可能就此排除了肌动蛋白丝和5—磷脂酶同时结合到CLP上的可能性。

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第一部分钩端螺旋体homoserine O-acetyltransferase（HTA）的结构解析与催化机理研究

第一章：背景知识

1.1 HTA在Methionine合成途径中的位置

1.2 几类已知结构的转乙酰酶

1.2.1 丝氨酸乙酰转移酶

1.2.2 组氨酸乙酰转移酶

1.2.3 胆碱乙酰转移酶

1.2.4 肉毒碱乙酰转移酶

1.3 a／β水解酶超家族

1.4 HTA研究进展

1.5 本课题的意义

第二章：质粒构建,蛋白表达和纯化

2.1 HTA质粒构建

2.2 LiHTA蛋白表达

2.2.1 Native的LiHTA蛋白表达

2.2.2 硒代LiHTA蛋白表达

2.2.2.1 经典的硒代蛋白表达方法

2.2.2.2 简化的硒代蛋白表达方法

2.3 HTA蛋白纯化

2.3.1 菌体破碎

2.3.2 DEAE-Sephadex阴离子交换柱层析

2.3.3 Superdex G75分子筛层析

第三章 LiHTA转乙酰基的活性测定

3.1 酶活测定方法

3.2 试验结果及讨论

3.2.1 LiHTA纯化过程中的酶活测定

3.2.2 LiHTA对底物的Km值

3.2.3 LiHTA的失活

3.2.4 保护剂对LiHTA酶活的作用

第四章：晶体生长、数据收集和结构解析

4.1 晶体生长

4.2 数据收集

4.3 结构解析

4.3.1 数据分析

4.3.2 寻找硒原子的位置

4.3.3 相位解析

4.3.4 模型搭建

4.3.4.1 自动建模

4.3.4.2 手动建模

4.4 结构修正

4.5 模型质量分析

第五章：结构与功能结果分析

5.1 LiHTA整体结构

5.2 HTA家族的系统进化树

5.3 HTA家族的序列保守性

5.4 LiHTA催化位点

5.5 催化三联体中的H344和S153处于双构象

第六章：结构与功能结果讨论

6.1 aL4的disorder与LiHTA在溶液中的单体状态相关

6.2 推测LiHTA的催化机理

6.3 尚未解决的问题

6.3.1 底物特异性

6.3.2 中间态和催化机理

参考文献（1）

第二部分人的Coactosin-like Protein（CLP）结构解析

第一章前言

1.1 肌动蛋白结合蛋白

1.2 ADF-H结构域

1.3 CLP介绍

第二章：基因克隆、表达和蛋白纯化

2.1 试剂

2.2 方法

2.2.1 hCLP基因的PCR扩增

2.2.2 PCR产物的纯化

2.2.3 pMD 18-T-hCLP的构建

2.2.4 pMD 18-T-hCLP阳性克隆的筛选

2.2.5 重组蛋白在pET22b（+）载体中的表达

2.2.6 重组蛋白的表达纯化

2.2.7 蛋白浓度测定

2.2.8 质谱分析

2.3 结果和讨论

2.3.1 基因克隆和表达载体的构建

2.3.2 hCLP的纯化

2.3.3 浓度测定

2.3.4 质谱分析

第三章：晶体生长

第四章：数据收集、结构解析和模型修正

4.1 数据收集

4.2 结构解析

4.2.1 分子置换法

4.2.2 多波长反常散射法

4.2.3 分子置换法解其它两套数据的结构

4.3 模型修正

4.3.1 2.8（?）的MAD数据修正

4.3.2 高分辨率数据的修正

4.4 模型质量分析

第五章：hCLP结构解析的结果和讨论

5.1 hCLP整体结构

5.2 三个hCLP的结构比较和晶体堆积分析

5.3 所有目前已知的CLP的结构比较

5.4 hCLP与其他ABP的结构比较

5.5 从结构解释CLP与actin结合的特异性

5.6 与F—actin和5LO结合位点的相互关系

5.7 对Capping蛋白的阻碍并不影响actin的聚合

第六章：前瞻——关于hCLP还未解决的问题

6.1 CLP与F—actin的结合模式：为何不与G—actin结合

6.2 coactosin／CLP如何抑制capping protein的活性

6.3 CLP和5LO的结合方式

参考文献（2）

附录一：常用试剂和溶液,常规实验方法

附录二：博士在读期间论文发表

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