番荔枝内生真菌的分离、鉴定、活性筛选及次级代谢产物的初步研究

论文摘要

天然产物是药物的重要来源。从植物内生真菌的次级代谢产物中,可以分离到许多结构新颖,生物活性多样的化合物。因此,药用植物内生真菌的研究,是发现新药的有效的发展途径。本论文于2005年至2006年不同的季节,从药用植物番荔枝的叶、枝条、树皮和根部中共分离到131株番荔枝内生真菌。以抗菌模型,抗肿瘤模型,抗氧化活性模型,抗卤虫模型,胰蛋白酶抑制模型和乙酰胆碱酯酶抑制模型对上述番荔枝内生真菌的发酵提取物进行活性筛选。生物活性测定结果显示,供测菌株中有71株具有一种或者几种生物学活性。其中,56株对5种指示菌显示出一种或者几种的抗菌活性,占供测菌株的42.8%;33株显示出对Raji、Hep G2细胞的抗肿瘤活性,占供测菌株的25.2%;具有抗氧化、抗卤虫、胰蛋白酶和乙酰胆碱酯酶抑制活性的菌株分别为20株、25株、7株和0株,分别占供测菌株的15.3%、19.1%、5.3%和0.0%。通过ITS rDNA的分析,对63株番荔枝内生真菌活性菌株进行了分子鉴定,结果表明63株活性菌株至少分布于19个属中。其中镰刀菌,Diaporthe,拟茎点霉和曲霉是番荔枝内生真菌活性菌株的优势属,分别占番荔枝内生真菌活性菌株的23.8%,15.9%,12.7%和7.9%。系统发育树显示,除菌株A10、A26属于担子菌门（Basidiomycota）,其余的菌株分属于子囊菌门的9个目中,包括了Botryosphaeriales,间座菌目（Diaporthales）,肉座菌目（Hypocreales）,麦角菌目（Clavicipitales）,黑痣菌目（Phyllachorales）,粪壳菌目（Sordariales）,炭角菌目（Xylariales）,散囊菌目（Eurotiales）和格孢腔菌目（Pleosporales）,显示出了良好的分类地位多样性。采用3对引物LC1-LC2c,LC3-LC5c和KS3-KS4c来探讨番荔枝内生真菌聚酮合酶基因多样性。扩增了63株生物活性菌株的KS结构域。结果11株（17%）能够被3对引物扩增,产生大小约700 bp的扩增产物;13株（21%）仅能够被2对引物扩增;18株（29%）仅能够被1对引物扩增;而21株（33%）没有扩增产物。显示了内生真菌聚酮合酶基因的多样性。对2株番荔枝内生真菌活性菌株,B27（拟茎点霉）和B38（炭团菌）的次级代谢产物进行了初步的研究。从菌株B27的次级代谢产物中分离并鉴定了5个化合物,包括了一个新化合物（LX-1）,命名为phomolide C,为十元环的大环内酯;4个已知结构的化合物（LX-2,LX-17,LX-6,LX-13）,分别为1-甲氧基-8-羟基-9,10-蒽醌,1,8-二羟基蒽醌,cytosporone C,Altiloxin A。从菌株B38的次级代谢产物中也分离5个已知结构的化合物（B38-3,B38-4,B38-1,B38-2,B38-5）,分别为Lachnellin C,Lachnellin B,Lachnellin D,Dienetriol 9,1,3-Benzodioxol-5-ylmethanol。对分离到的10个化合物的抗菌活性及抗肿瘤活性进行了研究。上述的10个化合物在每片滤纸片含有50μg样品（滤纸片法）时没有显示出抗菌（5种指示菌）活性;抗肿瘤实验结果显示,浓度为50μg/mL时,仅化合物LX-1,B38-4对HeLa细胞有微弱的抑制活性,IC50分别为42μg/mL和49μg/mL。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、植物内生真菌及其次级代谢产物
• 1.植物内生真菌
• 2.植物内生真菌的次级代谢产物
• 2.1 抗菌活性物质
• 2.2 抗肿瘤活性物质
• 2.3 抗虫活性物质
• 2.4 其他活性物质
• 2.4.1 抗疟疾物质
• 2.4.2 抗氧化物质
• 2.4.3 非肽类胰岛素功能类似物
• 二、番荔枝及其植物活性成分
• 1.番荔枝内酯
• 2.多氧环己烯
• 3.苯乙烯内酯
• 三、真菌聚酮合酶基因
• 四、拟茎点霉次级代谢产物
• 五、炭团菌属次级代谢产物
• 六、本课题研究的目的、内容和意义
• 材料与方法
• 一、材料
• 二、方法
• 结果与分析
• 一、番荔枝内生真菌的分离
• 二、番荔枝内生真菌的活性筛选
• 1.抗菌活性的测定
• 2.抗氧化活性的测定
• 3.胰蛋白酶抑制活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定
• 4.抗卤虫活性的测定
• 5.抗肿瘤活性的测定
• 三、番荔枝内生真菌活性菌株的分类
• 1.番荔枝内生真菌活性菌株的分类鉴定
• 2.番荔枝内生真菌活性菌株的系统发育树
• 四、番荔枝内生真菌活性菌株PKS基因的初步研究
• 五、B27菌株次级代谢产物的研究
• 1.番荔枝内生真菌B27
• 2.番荔枝内生真菌B27的发酵及培养物处理
• 3.番荔枝内生真菌B27的发酵产物的分离纯化
• 3.1 石油醚相次级代谢产物的分离纯化
• 3.2 乙酸乙酯相次级代谢产物的分离纯化
• 3.2.1 EA-G组分的分离纯化
• 3.2.2 EA-H组分的分离纯化
• 3.2.3 EA-I组分的分离纯化
• 4.化合物的结构解析
• 4.1 化合物LX-1
• 4.2 化合物LX-2
• 4.3 化合物LX-17
• 4.4 化合物LX-6
• 4.5 化合物LX-13
• 六、B38菌株次级代谢产物的研究
• 1.番荔枝内生真菌B38
• 2.番荔枝内生真菌B38的发酵及培养物处理
• 3.番荔枝内生真菌B38的发酵产物的分离纯化
• 3.1 EA-A-#24-37组分的分离纯化
• 3.1.1 #7-9（28mg）的分离纯化
• 3.1.2 #10-14（40mg）的分离纯化
• 3.1.3 #18-19（120mg）的分离纯化
• 3.2 EA-A-#48-56（40mg）的分离纯化
• 4.化合物B38-1的乙酰化及分离纯化
• 5.化合物结构解析
• 5.1 化合物B38-3和B38-4
• 5.2 化合物B38-1和B38-1（R）
• 5.3 化合物B38-2
• 5.4 化合物B38-5
• 七、化合物生物活性的检测
• 讨论与结论
• 一、番荔枝内生真菌生物活性多样性
• 二、番荔枝内生真菌活性菌株多样性
• 三、番荔枝内生真菌活性菌株PKS基因多样性
• 四、菌株B27、B38的次级代谢产物及其生物活性
• 1.化合物LX-1
• 2.化合物LX-2和LX-17
• 3.化合物LX-6
• 4.化合物LX-13
• 5.化合物B38-3,B38-4,B38-1,B38-2
• 6.化合物B38-5
• 五、结论与展望
• 参考文献
• 常用英文缩写
• 致谢
• 附录