基于磁球技术的DNA单分子的体积放大以及电化学检测

论文摘要

本论文分为二章,第一章是基于体积放大技术的DNA单分子目视检测;第二章是基于纳米磁球介导酶联DNA单分子电化学检测。在第一章中我们提出了一种简单的基于体积放大技术的DNA单分子检测方法。该方法分为三步:首先利用生物素与链霉亲和素的特异性反应将生物素化的DNA捕捉探针固定在链霉亲和素修饰的聚乙烯板上,然后滴加目标DNA溶液,使其与捕捉探针杂交。第二步,取一定量链霉亲和素修饰的5.91μm的磁球与过量的生物素化的检测探针反应,利用磁分离除去过量的检测探针。最后,将第一、第二两步反应的产物按一定比例混合,进行第二次杂交反应,通过目标DNA与检测探针的杂交,使形成捕捉探针—目标—检测探针—磁球的结构,进而将磁球固定在聚乙烯板上。用倒置显微镜以×25倍或×40倍物镜用CCD照像或×250或×400倍用眼观察。如果在上面的第一步中,使固定在微孔板上的目标DNA足够稀,通过杂交反应最终一个磁球上只结合一个目标DNA分子,这样,通过对磁球的计数检测,就等于实现对单个DNA分子的计数检测。该方法的最大优点是不需用复杂而昂贵的仪器,只用普通的显微镜配合常用的CCD（也可用目视）就可进行单个目标DNA分子的检测。本章就杂交缓冲溶液的浓度、杂交方式、清洗次数和反应时间进行了讨论,得到了最佳的杂交实验条件。使用MetaMorph软件对磁球进行计数,实现了对目标DNA单分子计数检测,线性范围5×10-16-1×10-14mol/L。在第二章中,建立了一种电化学检测单个DNA分子的新方法。该方法基于核酸功能化的纳米磁球实现DNA的初步放大,然后利用磁球表面的碱性磷酸酶的催化反应实现第二次信号放大,最后利用毛细管作为单分子取样通道并于柱端进行电化学检测。该方法具有以下几个优点:（1）灵敏度高。在本实验中,不是通过检测目标DNA而是碱性磷酸酶催化底物得到的产物苯酚,苯酚通过磁球技术的DNA放大以及酶放大两步放大反应得到,使检测信号大大增强。（2）重现性好。在电化学检测中电极表面的电化学活性的不稳定常会导致电信号的重现性变差,而本方法不是根据信号的强度,而是根据峰的个数来检测目标DNA,所以信号强度的重现性对实验不是很重要。这一特点使方法的重现性优于常规的电化学检测。（3）该实验不需要昂贵的仪器设备,磁球与链霉亲和素修饰的聚苯乙烯板都已经商品化。通过磁球技术与酶催化两步放大相结合实现了用电化学手段对单个DNA分子的定性及定量检测,检测线性范围5×10-16-1×10-13mol/L。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号与缩写
• 第一章 基于体积放大技术的单个DNA分子的检测
• 1.1 引言
• 1.2 实验部分
• 1.2.1 实验仪器
• 1.2.2 材料与试剂
• 1.2.3 实验方法
• 1.2.3.1 高压灭菌
• 1.2.3.2 磁球的清洗
• 1.2.3.3 DNA的单分子显微观测
• 1.2.3.3.1 检测探针在磁球表面的化学键合
• 1.2.3.3.2 捕捉探针及目标DNA在聚乙烯微孔板上的固定
• 1.2.3.3.3 键合上探针的磁球与微孔板内里的目标DNA的结合定
• 1.2.3.3.4 显微镜观测
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 目标DNA、捕捉探针和检测探针的选择与确定
• 1.3.2 杂交条件的选择
• 1.3.2.1 杂交方式的选择
• 1.3.2.2 杂交缓冲液浓度的选择
• 1.3.2.3 磁球与目标DNA,捕捉与目标DNA的比例选择
• 1.3.2.4 清洗次数的选择
• 1.3.2.5 磁球的计数
• 1.3.2.6 杂交时间的选择
• 1.3.3 DNA单分子计数检测线性范围
• 1.3.4 误差讨论
• 1.4 结论
• 1.5 参考文献
• 第二章 基于纳米磁球技术对DNA单分子的电化学检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 材料与试剂
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 检测探针1在磁球表面的化学键合
• 2.2.3.2 捕捉探针及目标DNA在聚乙烯微孔池内的固定
• 2.2.3.3 键合探针1的磁球与微孔池上的目标DNA的结合
• 2.2.3.4 磁球从微孔板上解脱及用碱性磷酸酶修饰
• 2.2.3.5 AP-labeled MNBs以及AP-p2-DNA-p1-DNA-MNBs的制备
• 2.2.3.6 荧光标记磁球荧光强度的测定
• 2.2.3.6.1 微升级检测池的制作
• 2.2.3.6.2 键合探针1磁球的荧光标记和荧光强度的测定
• 2.2.3.6.3 聚乙烯板上的键合探针1磁球的荧光标记及测定
• 2.2.3.7 电化学检测碱性磷酸酶修饰磁球
• 2.2.3.7.1 碳纤维束微盘电极的制作及处理
• 2.2.3.7.2 循环伏安法测苯酚
• 2.2.3.7.3 碱性磷酸酶修饰的磁球的电化学检测装置
• 2.2.3.7.4 碱性磷酸酶修饰的磁球的电化学检测
• 2.2.3.7.5 从微孔板上解脱磁球的电化学检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 检测探针1在磁球表面的化学键合
• 2.3.2 捕捉探针及目标DNA在链霉亲和素修饰聚乙烯微孔板上的固定
• 2.3.3 单个键合探针1的磁球与微孔板上单个目标DNA的结合以及磁球从微孔板上解脱
• 2.3.4 苯酚的循环伏安特性
• 2.3.5 对应单个目标DNA分子的单个AP-p1-DNA-p2-DNA-MNB的电化学检测
• 2.3.6 目标DNA分子的定量测定
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表