西藏飞蝗和东亚飞蝗的线粒体基因组全序列的测定及分析

论文摘要

西藏飞蝗（Locusta migratoria tibetensis）和东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis）隶属于直翅目（Orthoptera）、蝗亚目（Caelifera）、蝗总科（Aridoidea）、斑翅蝗科（Oedipodidae）、飞蝗属（Locusta L.）。飞蝗属已知1种,包括9个亚种,其中分布于我国的有3个亚种,分别为:东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）、亚洲飞蝗（Locusta migratoria migratoria）和西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）。传统的形态分类学研究认为,分布在蒙新高原的飞蝗属于亚洲飞蝗（Locusta m. migratoria）,分布于广大华北及以南地区的为东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）,分布于西藏地区的飞蝗为西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）。本论文以采自青海玉树的西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）和采自保定的东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）为材料,应用蛋白酶K消化法提取总DNA,根据同源序列设计引物,测定了2亚种线粒体基因组全序列,利用ClustalX、DNAMAN和MAGE等软件对西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）和东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）的线粒体基因全序列进行分析,同时从GenBank下载非洲飞蝗（Locusta migratoria migratorioides）（登录号:NC-001712）和亚洲飞蝗（Locusta m. migratoria）（登录号:NC-011119）的线粒体基因组全序列,采用最大简约法、邻接法和贝叶斯法重建4个亚种的系统发育关系,得到以下的结论:1西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）和东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）的线粒体基因组序列全长分别为15568bp和15902bp,为封闭的环状结构,有13条蛋白质基因,22条tRNA基因, 2条rRNA基因,还有一个A+T富含区,其中主链（majority-strand）即H-链中有23条基因,包括14条tRNA基因和9条蛋白质基因。次链（minority-strand）（L-链）中包括了14条基因,包括8条tRNA基因、2条RNA（lrRNA,16s和srRNA,12s）和4条蛋白质基因。全序列中都表现出了很高的AT偏向性,尤其是在A+T富含区内,这个特点与节肢动物的线粒体基因AT含量偏高的特点是一致的。2西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）和东亚飞蝗（Locusta m.manilensis）都有基因重叠和基因间隔区域,西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）的线粒体基因存在有5个基因重叠区域共36bp,重叠长度为2-12bp不等,平均重叠长度为7.5bp。东亚飞蝗（Locusta m.manilensis）的重叠区数和西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）的很相似,为6处,但是总的碱基重叠数比西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）的少8bp,为28bp,平均重叠长度为4.67bp。在基因间隔方面,西藏飞蝗（Locusta m.tibetensis）的线粒体基因组的全序列中存在17处的基因间隔,共计106bp,平均间隔为6.24bp。在东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）中共有16处基因间隔,比西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）少一处,间隔基因总数为104bp,平均间隔为6.5bp。基因重叠的数目越多和基因间隔的碱基数目越小,说明线粒体基因的碱基排列越紧密、碱基的利用率越高。3西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）和东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）的线粒体基因中所含的蛋白质基因的起始密码子中除了cox1的起始密码子非常特殊以外,其余的所有蛋白质基因的起始密码子都为典型的ATN。在本实验中通过分析得出;西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）和东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）的cox1蛋白质基因的起始密码子为ATGA。在2飞蝗亚种的线粒体蛋白质基因的终止密码子中,有一个以不完整的TA结尾;5个以单碱基T结尾,另外还有7个以TAA作为终止密码子。目前认为通过转录后加工时的多聚腺苷酸作用（post-transcriptional polyadenylation）可以将这些不完整的终止密码子修补为完整的TAA终止密码。这一点也说明线粒体基因拥有高效的利用率。4将2飞蝗亚种的线粒体基因组全序列分别通过Scan-tRNA软件进行tRNA二级结构预测,结果发现,除了trnS（AGN）的二级结构中缺少DHU臂的结构以外,其它的tRNA都能形成典型的三叶草二级结构。5以蛋白质基因序列为研究序列,通过MEGA 4.1、PHYLIP和MrBayes 3.1.2软件重建4飞蝗亚种的系统关系树,结果表明:东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）和西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）以100的相似度聚为一支,亲缘关系最近。4飞蝗亚种之间的亲缘关系为（（（西藏飞蝗,东亚飞蝗）,亚洲飞蝗）,非洲飞蝗）。支持形态分类学观点:分布在蒙新高原的飞蝗属于亚洲飞蝗（Locusta m. migratoria）,分布于广大华北及以南地区为东亚飞蝗（Locusta m. manilensis）,分布于西藏地区的飞蝗是西藏飞蝗（Locusta m. tibetensis）,支持西藏飞蝗作为亚种的分类地位。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 序言
• 第一部分 前言
• 1 线粒体的发现与特点
• 1.1 线粒体的发现史
• 1.2 线粒体基因组的长度
• 1.3 线粒体基因组的结构特点
• 1.4 线粒体的tRNA 二级结构的特点
• 1.5 线粒体基因组研究现状
• 1.6 线粒体基因组的研究意义
• 1.7 线粒体基因组的研究方法
• 2 飞蝗的研究现状
• 2.1 西藏飞蝗和东亚飞蝗的分类地位
• 2.2 中国飞蝗属亚种的划分
• 2.3 飞蝗 4 亚种之间的系统发育关系
• 第二部分 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 标本的采集、保存和鉴定
• 1.2 实验药品
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 总DNA 的提取及质量检测
• 2.2 引物的合成
• 2.3 基因片段的扩增
• 2.4 纯化及电泳检测
• 2.5 亚PCR 扩增和基因片段的克隆
• 第三部分 结果分析和讨论
• 1 线粒体基因序列的拼接与分析
• 1.1 西藏飞蝗线粒体基因组序列的拼接结果
• 1.2 东亚飞蝗线粒体基因组序列的拼接结果
• 2 飞蝗的线粒体基因组核苷酸序列分析
• 2.1 西藏飞蝗的线粒体基因的特点
• 2.2 东亚飞蝗的线粒体基因结构特点
• 2.3 基因重叠现象
• 2.4 基因间隔区
• 2.5 碱基组成的分析
• 3 飞蝗线粒体基因蛋白质编码基因分析
• 3.1 蛋白质基因的碱基组成偏向性
• 3.2 4 飞蝗亚种的碱基替换分析
• 3.3 蛋白质起始密码子的使用情况
• 3.4 蛋白质终止密码子的使用情况
• 4 tRNA 的基因及预测结构的特点
• 4.1 tRNA 基因的特点
• 4.2 tRNA 的预测结构及特点
• 5 AT 富含区（A+T-Rich Region）
• 6 系统发育关系
• 6.1 标本信息
• 6.2 4 飞蝗亚种的遗传距离
• 6.3 重建4 飞蝗亚种之间的系统树
• 第四部分 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间取得的科研成果