导读:本文包含了体外翻译系统论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:体外翻译,核糖体,工作机理
体外翻译系统论文文献综述
林金钟[1]（2019）在《核糖体的工作机理与人源体外翻译系统的全重构》一文中研究指出核糖体翻译合成蛋白质是个极其动态复杂的反应,几乎每一步都需要相应的翻译因子催化进行。过去几十年的结构生物学研究使我们对核糖体的构造在原子分辨率水平有了深刻的理解,但是翻译因子和核糖体协同互作的机理还不是很明朗。我们一直致力于解析核糖体与翻译因子复合物的高分辨率结构,以阐明蛋白质翻译合成与调控的分子机理。这次报告中我将介绍翻译终止后终止因子RRF和EF-G如何催化核糖体回收再循环的分子机制。另外,目前对翻译调控的研究远远落后于转录调控,一个主要原因是缺乏有效的生化研究体系。为了解决这一问题,我们正在构建人源全重组体外翻译系统用于研究mRNA翻译过程,我将介绍我们在这一尝试上的最新进展。(本文来源于《中国生物化学与分子生物学会2019年全国学术会议暨学会成立四十周年论文集》期刊2019-10-24）
王晓[2]（2008）在《人乳头瘤病毒L1基因在酵母体外翻译系统和原代角质细胞中的表达研究》一文中研究指出人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是能引起人类皮肤粘膜多种良、恶性增殖性疾病的一类肿瘤相关病毒。目前,人们已经成功分离出了200多个型别的HPV。根据致病性的不同,又可将其中感染生殖道的HPV分为低危型和高危型。低危型HPV包括1,2,6,11等型,主要引起良性瘤或疣,如扁平疣和尖锐湿疣;高危型HPV包括16,18,45,58等型,主要引起皮肤粘膜的恶性肿瘤,如宫颈癌等。对HPV生物学特征的研究表明,HPV为无包膜的8kb左右的双链DNA病毒,基因组可分为3个区:非编码区,早期区和晚期区。其中,晚期区含有L1和L2两个ORFs,编码病毒的主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白,共同组成病毒的衣壳。然而,HPV的生活周期依赖于表皮宿主细胞的分化,晚期衣壳蛋白合成和病毒颗粒装配只能在上皮终末分化细胞中进行。HPV的这一特性限制了病毒的体外培养,延缓了对HPV各个基因的表达和功能的研究,尤其是阻碍了晚期蛋白表达的研究。迄今为止人们虽已成功地利用多种原核和真核的表达系统进行了HPV晚期基因的表达研究,并实现了HPV主要型别的病毒样颗粒的体外合成和组装,但是对于HPV L1基因表达的调控,病毒颗粒的形成和DNA包装的分子机制的研究仍不完全清楚。而进一步阐明这些分子机制对于疫苗设计,抗病毒药物筛选及病毒与宿主之间的相互作用的研究大有裨益。人乳头瘤病毒58型(HPV58)是一种高危型的HPV病毒,与宫颈癌的发生密切相关。流行病学研究表明,HPV58在亚洲地区宫颈癌的发生中扮演着重要角色;在我国HPV58型仅次于HPV 16型、18型与宫颈癌发生关系密切。目前,国内外对HPV58型的研究较少,基于HPV58型在我国妇女宫颈癌发生中的特殊位置,其相关研究对开发适合中国人群的HPV基因工程疫苗具有重大的现实意义。现已发现,大部分宫颈癌相关HPV型别的L1序列都可以产生两种L1蛋白,全长型L1(从第一个ATG开始翻译)和截短型L1蛋白(从第二个ATG开始翻译)。有研究推测,全长型L1蛋白主要在高危型HPV感染的上皮中合成,并可能参与宫颈癌的进展,而病毒颗粒主要由截短型L1蛋白组成。因此,全长和截短型L1蛋白的表达及病毒样颗粒的组装研究对于阐明HPV的致癌机制及疫苗的研究具有重要意义。经比较发现,HPV58L1的编码序列中也同样含有两个ATG,然而,目前对于HPV58全长和截短型L1蛋白表达的相关研究仍不清楚。HPV58能否形成这两种L1蛋白?哪一个L1蛋白可以组装成VLP颗粒?HPV58L1基因在不同翻译系统中的表达情况如何?这些问题的答案尚属未知。体外翻译系统是研究基因表达和调控的强大工具。酵母体外翻译系统已被用来进行多种哺乳动物和病毒的mRNA的翻译研究。与其他体外翻译系统相比,它存在众多优势,为研究病毒基因表达的调控机制和其对遗传和生理因素改变的反应等提供了独特的工具。然而,迄今为止,还没有关于HPV的mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译的研究。在本研究中,我们首次建立了一种优化的适合于HPV58L1mRNA翻译的酵母体外翻译系统,并成功地对系统进行了几个因素的优化,进而利用该系统进行了HPV58长短L1 mRNA体外翻译和病毒样颗粒组装的研究。众所周知,PV晚期蛋白的翻译在转录后水平有复杂的调控机制,然而至今没有任何实验数据可以解释为何分化的角质细胞容许野生型PV L1序列的翻译以及宿主细胞的分化情况如何调节L1蛋白的表达。以往研究证实,基因序列中的密码子使用情况可以显着影响其在宿主细胞中的表达水平,通过优化密码可以增强PV早晚期蛋白的表达。这一现象提示,密码子的使用情况与tRNA种类之间的匹配可能是影响病毒基因表达机制的一个重要因素。有研究显示,PV L1蛋白不能有效表达与特定的tRNA的缺乏有关,特别是稀有密码子tRNAs。然而,tRNA丰度和其调控基因表达的功能只有非常有限的实验数据。至今我们也不清楚在细胞内tRNA的丰度如何调节细胞内靶基因的表达。优化密码提高蛋白表达的机制尚待进一步探讨。为进一步阐明L1基因表达的分子调控机制,我们利用不同分化阶段的小鼠和人的原代角质细胞培养系统和角质细胞体外翻译系统,研究野生型和优化型的HPV6bL1基因随细胞分化的不同转录和翻译特点,试图进一步解析影响L1蛋白在角质细胞中表达的分子调控机制。一、HPV58L1 mRNA在优化的酵母体外翻译系统中的表达研究研究中首先以含有HPV58全基因组的质粒pLink322-HPV58为模板,PCR法扩增HPV58全长型L1基因(LL1)和截短型L1基因(SL1)并连接到真核表达载体pcDNA3.0上,构建出真核重组质粒pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1,经酶切和测序鉴定序列无误。进而利用体外转录试剂盒将pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1中的L1基因体外转录为相应的长短L1 mRNA备用。为构建酵母体外翻译系统,我们首先制备了酵母的原生质体,然后根据以往报道方法制备啤酒酵母细胞的裂解物,并对制备过程进行了调整和改良。考虑到裂解缓冲液中的镁离子,钾离子浓度会影响外源性mRNA翻译活性,我们针对HPV58L1mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译条件需求对镁离子和钾离子浓度进行了优化。为检测蔗糖对酵母裂解物稳定性的影响,我们在裂解物的制备过程中分别加入不同浓度的蔗糖,并检测其对系统的保护作用。为确定系统优化后翻译效率的提高程度,检测了优化前后酵母系统对HPV58SL1的翻译效率,并比较了与商品化的兔网织红细胞体外翻译系统(RRL)的翻译效率的差异,已知剂量的HPV6bL1蛋白作为信号强度对照。结果显示,我们构建的体外翻译系统对HPV58L1 mRNA翻译活性良好。镁离子和钾离子对L1蛋白翻译的影响显着,镁离子在裂解缓冲液中浓度为2.2mM时系统翻译活性最高,钾离子的最佳浓度为220mM。加入蔗糖后裂解物的抗冻融能力都有较大的提高,蔗糖的最佳浓度为100mM。对酵母体外翻译系统进行优化后,HPV58SL1 mRNA的翻译效率比RRL系统高出2倍。经计算,优化前1μg SL1mRNA在1毫升反应液中蛋白的产量为20—40μg,优化后为50-70μg,产量提高了1倍。为进一步研究HPV58长短L1 mRNA在该系统中的翻译特点和差异,我们在优化的酵母体外翻译系统中加入HPV58全长和截短型L1 mRNA,分别进行体外翻译反应。反应过程中改变反应时间、L1 mRNA模板量,加入外源性氨基酸或亮氨酸和酵母的氨基酰tRNA等,观察其对长短L1蛋白合成的影响。结果显示HPV58长短L1 mRNA均可以在酵母系统中获得良好的表达。对比两者的翻译模式,截短型L1翻译启动迅速,10分钟内即达最高表达量;全长型L1翻译启动较慢,反应30分钟后表达量与截短型持平。提示全长型L1蛋白的翻译依赖于反应时间,而截短型L1则不明显。随初始mRNA模板量的增高,两种L1蛋白信号均明显增强,但截短型L1 mRNA翻译水平仍明显高于全长型L1mRNA。外源性的氨基酸的加入仅可以显着提高全长型L1蛋白的翻译,而对截短型L1蛋白的翻译没有影响,提示内源性的氨基酸无法满足全长L1蛋白合成的需要。加入外源性酵母aa—tRNA对两种L1蛋白的翻译均无明显影响,提示系统中内源性的tRNA可充分满足HPV58两种L1 mRNA的表达。为进一步揭示长短L1蛋白合成效率的差异原因,我们在反应系统中加入不同浓度的外源性的亮氨酸,观察其对两种L1蛋白合成的影响。为检测体外合成的L1蛋白是否可以组成VLP颗粒,将体外翻译的反应液直接进行蔗糖超速离心后透射电镜检测VLP颗粒的形成。Western Blot结果显示,亮氨酸可以提高全长型的L1mRNA的翻译水平,且效应呈亮氨酸剂量依赖性;而截短型L1翻译不受影响。实验结果表明,系统中亮氨酸的缺乏是限制HPV58全长型L1表达的重要因素,这是由于长L1蛋白起始序列中亮氨酸的高频率使用所导致。电镜结果显示全长和截短型L1蛋白均可以组装成VLP颗粒。综上所述,本部分中我们成功地构建了一种新型的适合HPV58L1蛋白合成的酵母无细胞翻译系统。通过对HPV58L1蛋白合成所需的各成分浓度进行优化,显着提高了系统对L1 mRNA的翻译效率,经优化后首次观察到了系统中HPV58VLP的形成。因而该系统成为继RRL系统后的第二个可进行HPV L1病毒样颗粒组装的体外翻译系统。我们进一步利用该系统探索并揭示了导致长短L1 mRNA翻译差异的原因,并首次观察到了HPV58长短L1蛋白组装的VLP颗粒。HPW酵母体外翻译系统具有的开放性和高度可操作性等独特优势,因而该系统有望用于1)研究HPV 58 L1蛋白在酵母中表达的影响因素,为提高L1蛋白表达产量、完善VLP酵母基因工程疫苗的生产、开发提供重要的借鉴;2)探讨HPV VLP组装的分子机制,为提高酵母中VLP形成效率,减少其与天然病毒颗粒的免疫原性差异等研究提供一个方便快捷的工具;3)研究HPV DNA包装的分子机制,为今后探讨长短L1蛋白包装的病毒颗粒的感染力和感染机制的差异以及抗病毒新靶点的筛选等研究提供良好的平台。目前,研究成果已申请国家发明专利一项(公示期)。同类研究尚未见报道。二、HPV6b L1基因在原代角质细胞培养系统中的表达研究为了检测基因密码组成对L1基因在持续分化的角质细胞中表达的影响,我们用HPV6b野生型和优化型的L1真核表达质粒瞬时转染培养一天的鼠角质细胞。转染后的D3,D6,D9,D12分别收集鼠角质细胞提取RNA和蛋白。对细胞固定后进行免疫荧光染色后镜下观察。实时荧光定量PCR检测提取的RNA样品中L1基因的转录水平。Western Blot方法检测L1蛋白的合成情况。镜下显示:随着转染时间的增长,细胞显示出明显的逐步增强的细胞分化特征,免疫荧光染色结果也显示,角质细胞终末分化的标志性蛋白外皮蛋白(involucrin)在细胞内的表达也随转染时间的延长而明显增强。实时荧光定量PCR结果显示,转染后角质细胞可以持续转录野生和优化型的L1 mRNA至少12天,而且优化型的L1 mRNA的水平始终显着高于野生型L1,这表明对GC结尾的密码子进行优化可以促进L1基因在KC细胞内的转录。随着细胞的分化,野生型和优化型的L1基因的转录水平都显着下降。Western Blot分析显示,野生型L1蛋白的表达随着细胞转染时间的延长而增强;优化型L1蛋白水平随着细胞转染时间的延长而降低。这表明L1 mRNA的密码子成分组成是调节L1蛋白在KC细胞内持续表达的一个重要因素;HPV L1蛋白的表达是转录后水平调节,同时与细胞的分化水平显着相关。甲硫氨酸标记的L1蛋白免疫共沉淀实验显示,检测到的L1蛋白的持续表达是由于L1蛋白的持续合成,L1 mRNA的密码子组成是决定L1蛋白持续性合成的重要因素。考虑到人角质细胞是HPV感染的天然宿主细胞,我们检测了HPV6b L1真核表达质粒在原代人角质细胞内的表达情况。所得结果与鼠角质细胞中的结果相似。为了进一步证实tRNA对L1的翻译调控作用,我们检测了不同分化程度的人或鼠KC中分离的aa-tRNA对体外翻译系统中L1蛋白翻译的影响。结果表明,野生型L1 mRNA倾向于在分化的鼠KC细胞制备的裂解物中进行翻译,而优化型L1mRNA倾向于在低级分化的鼠KC细胞制备的裂解物中进行翻译。这一结果与L1转染的KC细胞中观察到的野生和优化L1蛋白的表达模式相同。这表明低级分化和完全分化的角质细胞中的aa-tRNA组成不同,因而可以不同程度的吻合HPV野生和优化型的L1 mRNA翻译的需要,从而可以调节它们在体外的翻译水平。综上所述,本研究中我们首次利用不同分化阶段的人和鼠原代角质细胞培养系统和体外翻译系统进行了L1蛋白翻译调控机制的研究。研究中首次探索了瞬时转染后的角质细胞中L1基因的转录和翻译时限,揭示了同义密码子的替换效应与细胞分化的密切关系。结果显示密码优化可以改变L1基因在细胞内的表达时效和表达模式,这种差异主要是由于分化阶段不同的角质细胞中的tRNA的组成不同,因而可以不同程度的调节野生型和优化型的L1基因的转录和翻译水平所致。所得结果为进一步阐明PV L1基因表达的分子调控机制提供了重要的实验数据和理论支持,同类研究尚未见报道。(本文来源于《山东大学》期刊2008-05-16）
孙峰[3]（2006）在《叶绿体基因编码蛋白的体外翻译系统构筑》一文中研究指出以高等植物豌豆和烟草叶绿体基因编码的蛋白D1,细胞色素f和细胞色素b_6为研究对象,采用分子生物学基因克隆,体外转录,蛋白质放射自显影分析技术,构建具有翻译活性的同源叶绿体体外翻译系统,以系统深入地研究叶绿体基因编码蛋白的类囊体膜插入合成组装调控的分子机制。所得结果摘要如下: (1)以完整的叶绿体DNA为模板,采用定向克隆策略,构建了具有高保真性能的叶绿体基因编码光系统蛋白D1,Cyt f和Cytb_6全长基因psbA,petA,petB。采用嵌套PCR方法体外连接烟草psbA 85bp翻译强启动子和petB全长基因,构建至体外转录载体pBluescript Ⅱ SK/KS(+/-)上;设计双酶切位点引物,克隆了D1(5跨膜区)和Cytb_6(4跨膜区)不同跨膜区截断片段基因(10种),新引入5'overhangs酶切位点消除了体外转录中的3'overhangs,避免了多转录物的产生。这为系统研究叶绿体基因编码蛋白何时何阶段稳定插入类囊体膜并组装成功能复合物提供了研究平台。 (2)构建了稳定的,高产,特异的体外转录系统。通过延长蛋白酶K消化时间,增加震荡次数,简化纯化步骤,降低了RNase污染转录体系的几率;向目的基因末端统一引入5'overhangs(Hind Ⅲ)的酶切位点,使得特异性地转录目的基因mRNA成为可能。对10种基因片段的体外转录实验显示,mRNA转录物产量从2.5-11.6mg/ml之间(纯度oD_(260/280)=1.75-1.85之间)。可作为外源添加的mRNA转录物来源,用于之后的体外翻译体系。 (3)制备出具有体外翻译活性的豌豆叶绿体30,000g基质上清(S30)提取液,通过大量种植高代谢活性,低核酸降解活性的幼龄期豌豆,Pcrcoll梯度方法提取完整的叶绿体,缩短提取S30时间,添加蛋白酶抑制剂等保护物质,有效提高S30蛋白质浓度(16-25mg/ml),获得一批具有很强翻译活性的S30提取液,体外翻译实验显示利用该S30提取液,翻译出含Cytb_6第一跨膜区(包含烟草psbA的启动子)的多肽蛋白。证实该系统具有翻译外源基因的能力。(本文来源于《兰州大学》期刊2006-05-01）
李前[4]（2002）在《体外翻译系统在分子生物学研究中的应用》一文中研究指出体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统 ,是分子生物学中一种常规的表达系统。该系统可用于蛋白质快速分析鉴定 ,基因转录和翻译的调控机理的研究以及分子间的相互作用的研究 ,如蛋白质和蛋白质的相互作用 ,蛋白质与 DNA的相互作用 ,蛋白质与 RNA的相互作用等(本文来源于《国外医学(分子生物学分册)》期刊2002年01期）
夏海滨,金伯泉,李恩善,许辉[5]（1992）在《非洲爪蛙卵母细胞系统 TLSF_(JM)mRNA 体外翻译研究》一文中研究指出应用酸性胍一步法从分泌 TLSF_(JM)的细胞系 JM 中提取总 RNA,进而纯化 mRNA,并应用微注射技术将纯化的 mRNA 注入非洲爪蛙卵母细胞中进行翻译表达。结果表明:非洲爪蛙卵母细胞能有效地翻译外源注入的 mRNA,翻译的 TLSF_(JM)产物主要滞留在卵母细胞内,仅有少量分泌到卵母细胞培养液中.TLSF_(JM) mRNA 体外翻译的成功为其 CDNA 文库的构建以及 TLSF_(JM)基因克隆和表达提供了重要的理论依据和实验基础.(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊1992年04期）
朱迅,杨贵贞[6]（1989）在《中华大蟾蜍卵母细胞系统IL-2受体mRNA体外翻译的研究》一文中研究指出本文采用中华大蟾蜍卵母细胞(BBO)体外翻译系统研究了不同来源细胞IL—2RαmRNA的翻译活性。显微注射mRNA的BBO用Barths液经20℃培养可获得最高翻译效率。与非州爪蟾卵母细胞的比较表明,两系统的体外翻译效率相近。对PHA刺激的人、脾淋巴细胞IL—2RαmRNA的合成动力学的观察表明,IL—2RαmRNA刺激后6小时即出现,9小时高达高峰,随后逐渐下降。放射受体分析显示,注射IL—2RαmRNA后,IL—2Rα也可表达于BBO膜表面。(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊1989年03期）
体外翻译系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是能引起人类皮肤粘膜多种良、恶性增殖性疾病的一类肿瘤相关病毒。目前,人们已经成功分离出了200多个型别的HPV。根据致病性的不同,又可将其中感染生殖道的HPV分为低危型和高危型。低危型HPV包括1,2,6,11等型,主要引起良性瘤或疣,如扁平疣和尖锐湿疣;高危型HPV包括16,18,45,58等型,主要引起皮肤粘膜的恶性肿瘤,如宫颈癌等。对HPV生物学特征的研究表明,HPV为无包膜的8kb左右的双链DNA病毒,基因组可分为3个区:非编码区,早期区和晚期区。其中,晚期区含有L1和L2两个ORFs,编码病毒的主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白,共同组成病毒的衣壳。然而,HPV的生活周期依赖于表皮宿主细胞的分化,晚期衣壳蛋白合成和病毒颗粒装配只能在上皮终末分化细胞中进行。HPV的这一特性限制了病毒的体外培养,延缓了对HPV各个基因的表达和功能的研究,尤其是阻碍了晚期蛋白表达的研究。迄今为止人们虽已成功地利用多种原核和真核的表达系统进行了HPV晚期基因的表达研究,并实现了HPV主要型别的病毒样颗粒的体外合成和组装,但是对于HPV L1基因表达的调控,病毒颗粒的形成和DNA包装的分子机制的研究仍不完全清楚。而进一步阐明这些分子机制对于疫苗设计,抗病毒药物筛选及病毒与宿主之间的相互作用的研究大有裨益。人乳头瘤病毒58型(HPV58)是一种高危型的HPV病毒,与宫颈癌的发生密切相关。流行病学研究表明,HPV58在亚洲地区宫颈癌的发生中扮演着重要角色;在我国HPV58型仅次于HPV 16型、18型与宫颈癌发生关系密切。目前,国内外对HPV58型的研究较少,基于HPV58型在我国妇女宫颈癌发生中的特殊位置,其相关研究对开发适合中国人群的HPV基因工程疫苗具有重大的现实意义。现已发现,大部分宫颈癌相关HPV型别的L1序列都可以产生两种L1蛋白,全长型L1(从第一个ATG开始翻译)和截短型L1蛋白(从第二个ATG开始翻译)。有研究推测,全长型L1蛋白主要在高危型HPV感染的上皮中合成,并可能参与宫颈癌的进展,而病毒颗粒主要由截短型L1蛋白组成。因此,全长和截短型L1蛋白的表达及病毒样颗粒的组装研究对于阐明HPV的致癌机制及疫苗的研究具有重要意义。经比较发现,HPV58L1的编码序列中也同样含有两个ATG,然而,目前对于HPV58全长和截短型L1蛋白表达的相关研究仍不清楚。HPV58能否形成这两种L1蛋白?哪一个L1蛋白可以组装成VLP颗粒?HPV58L1基因在不同翻译系统中的表达情况如何?这些问题的答案尚属未知。体外翻译系统是研究基因表达和调控的强大工具。酵母体外翻译系统已被用来进行多种哺乳动物和病毒的mRNA的翻译研究。与其他体外翻译系统相比,它存在众多优势,为研究病毒基因表达的调控机制和其对遗传和生理因素改变的反应等提供了独特的工具。然而,迄今为止,还没有关于HPV的mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译的研究。在本研究中,我们首次建立了一种优化的适合于HPV58L1mRNA翻译的酵母体外翻译系统,并成功地对系统进行了几个因素的优化,进而利用该系统进行了HPV58长短L1 mRNA体外翻译和病毒样颗粒组装的研究。众所周知,PV晚期蛋白的翻译在转录后水平有复杂的调控机制,然而至今没有任何实验数据可以解释为何分化的角质细胞容许野生型PV L1序列的翻译以及宿主细胞的分化情况如何调节L1蛋白的表达。以往研究证实,基因序列中的密码子使用情况可以显着影响其在宿主细胞中的表达水平,通过优化密码可以增强PV早晚期蛋白的表达。这一现象提示,密码子的使用情况与tRNA种类之间的匹配可能是影响病毒基因表达机制的一个重要因素。有研究显示,PV L1蛋白不能有效表达与特定的tRNA的缺乏有关,特别是稀有密码子tRNAs。然而,tRNA丰度和其调控基因表达的功能只有非常有限的实验数据。至今我们也不清楚在细胞内tRNA的丰度如何调节细胞内靶基因的表达。优化密码提高蛋白表达的机制尚待进一步探讨。为进一步阐明L1基因表达的分子调控机制,我们利用不同分化阶段的小鼠和人的原代角质细胞培养系统和角质细胞体外翻译系统,研究野生型和优化型的HPV6bL1基因随细胞分化的不同转录和翻译特点,试图进一步解析影响L1蛋白在角质细胞中表达的分子调控机制。一、HPV58L1 mRNA在优化的酵母体外翻译系统中的表达研究研究中首先以含有HPV58全基因组的质粒pLink322-HPV58为模板,PCR法扩增HPV58全长型L1基因(LL1)和截短型L1基因(SL1)并连接到真核表达载体pcDNA3.0上,构建出真核重组质粒pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1,经酶切和测序鉴定序列无误。进而利用体外转录试剂盒将pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1中的L1基因体外转录为相应的长短L1 mRNA备用。为构建酵母体外翻译系统,我们首先制备了酵母的原生质体,然后根据以往报道方法制备啤酒酵母细胞的裂解物,并对制备过程进行了调整和改良。考虑到裂解缓冲液中的镁离子,钾离子浓度会影响外源性mRNA翻译活性,我们针对HPV58L1mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译条件需求对镁离子和钾离子浓度进行了优化。为检测蔗糖对酵母裂解物稳定性的影响,我们在裂解物的制备过程中分别加入不同浓度的蔗糖,并检测其对系统的保护作用。为确定系统优化后翻译效率的提高程度,检测了优化前后酵母系统对HPV58SL1的翻译效率,并比较了与商品化的兔网织红细胞体外翻译系统(RRL)的翻译效率的差异,已知剂量的HPV6bL1蛋白作为信号强度对照。结果显示,我们构建的体外翻译系统对HPV58L1 mRNA翻译活性良好。镁离子和钾离子对L1蛋白翻译的影响显着,镁离子在裂解缓冲液中浓度为2.2mM时系统翻译活性最高,钾离子的最佳浓度为220mM。加入蔗糖后裂解物的抗冻融能力都有较大的提高,蔗糖的最佳浓度为100mM。对酵母体外翻译系统进行优化后,HPV58SL1 mRNA的翻译效率比RRL系统高出2倍。经计算,优化前1μg SL1mRNA在1毫升反应液中蛋白的产量为20—40μg,优化后为50-70μg,产量提高了1倍。为进一步研究HPV58长短L1 mRNA在该系统中的翻译特点和差异,我们在优化的酵母体外翻译系统中加入HPV58全长和截短型L1 mRNA,分别进行体外翻译反应。反应过程中改变反应时间、L1 mRNA模板量,加入外源性氨基酸或亮氨酸和酵母的氨基酰tRNA等,观察其对长短L1蛋白合成的影响。结果显示HPV58长短L1 mRNA均可以在酵母系统中获得良好的表达。对比两者的翻译模式,截短型L1翻译启动迅速,10分钟内即达最高表达量;全长型L1翻译启动较慢,反应30分钟后表达量与截短型持平。提示全长型L1蛋白的翻译依赖于反应时间,而截短型L1则不明显。随初始mRNA模板量的增高,两种L1蛋白信号均明显增强,但截短型L1 mRNA翻译水平仍明显高于全长型L1mRNA。外源性的氨基酸的加入仅可以显着提高全长型L1蛋白的翻译,而对截短型L1蛋白的翻译没有影响,提示内源性的氨基酸无法满足全长L1蛋白合成的需要。加入外源性酵母aa—tRNA对两种L1蛋白的翻译均无明显影响,提示系统中内源性的tRNA可充分满足HPV58两种L1 mRNA的表达。为进一步揭示长短L1蛋白合成效率的差异原因,我们在反应系统中加入不同浓度的外源性的亮氨酸,观察其对两种L1蛋白合成的影响。为检测体外合成的L1蛋白是否可以组成VLP颗粒,将体外翻译的反应液直接进行蔗糖超速离心后透射电镜检测VLP颗粒的形成。Western Blot结果显示,亮氨酸可以提高全长型的L1mRNA的翻译水平,且效应呈亮氨酸剂量依赖性;而截短型L1翻译不受影响。实验结果表明,系统中亮氨酸的缺乏是限制HPV58全长型L1表达的重要因素,这是由于长L1蛋白起始序列中亮氨酸的高频率使用所导致。电镜结果显示全长和截短型L1蛋白均可以组装成VLP颗粒。综上所述,本部分中我们成功地构建了一种新型的适合HPV58L1蛋白合成的酵母无细胞翻译系统。通过对HPV58L1蛋白合成所需的各成分浓度进行优化,显着提高了系统对L1 mRNA的翻译效率,经优化后首次观察到了系统中HPV58VLP的形成。因而该系统成为继RRL系统后的第二个可进行HPV L1病毒样颗粒组装的体外翻译系统。我们进一步利用该系统探索并揭示了导致长短L1 mRNA翻译差异的原因,并首次观察到了HPV58长短L1蛋白组装的VLP颗粒。HPW酵母体外翻译系统具有的开放性和高度可操作性等独特优势,因而该系统有望用于1)研究HPV 58 L1蛋白在酵母中表达的影响因素,为提高L1蛋白表达产量、完善VLP酵母基因工程疫苗的生产、开发提供重要的借鉴;2)探讨HPV VLP组装的分子机制,为提高酵母中VLP形成效率,减少其与天然病毒颗粒的免疫原性差异等研究提供一个方便快捷的工具;3)研究HPV DNA包装的分子机制,为今后探讨长短L1蛋白包装的病毒颗粒的感染力和感染机制的差异以及抗病毒新靶点的筛选等研究提供良好的平台。目前,研究成果已申请国家发明专利一项(公示期)。同类研究尚未见报道。二、HPV6b L1基因在原代角质细胞培养系统中的表达研究为了检测基因密码组成对L1基因在持续分化的角质细胞中表达的影响,我们用HPV6b野生型和优化型的L1真核表达质粒瞬时转染培养一天的鼠角质细胞。转染后的D3,D6,D9,D12分别收集鼠角质细胞提取RNA和蛋白。对细胞固定后进行免疫荧光染色后镜下观察。实时荧光定量PCR检测提取的RNA样品中L1基因的转录水平。Western Blot方法检测L1蛋白的合成情况。镜下显示:随着转染时间的增长,细胞显示出明显的逐步增强的细胞分化特征,免疫荧光染色结果也显示,角质细胞终末分化的标志性蛋白外皮蛋白(involucrin)在细胞内的表达也随转染时间的延长而明显增强。实时荧光定量PCR结果显示,转染后角质细胞可以持续转录野生和优化型的L1 mRNA至少12天,而且优化型的L1 mRNA的水平始终显着高于野生型L1,这表明对GC结尾的密码子进行优化可以促进L1基因在KC细胞内的转录。随着细胞的分化,野生型和优化型的L1基因的转录水平都显着下降。Western Blot分析显示,野生型L1蛋白的表达随着细胞转染时间的延长而增强;优化型L1蛋白水平随着细胞转染时间的延长而降低。这表明L1 mRNA的密码子成分组成是调节L1蛋白在KC细胞内持续表达的一个重要因素;HPV L1蛋白的表达是转录后水平调节,同时与细胞的分化水平显着相关。甲硫氨酸标记的L1蛋白免疫共沉淀实验显示,检测到的L1蛋白的持续表达是由于L1蛋白的持续合成,L1 mRNA的密码子组成是决定L1蛋白持续性合成的重要因素。考虑到人角质细胞是HPV感染的天然宿主细胞,我们检测了HPV6b L1真核表达质粒在原代人角质细胞内的表达情况。所得结果与鼠角质细胞中的结果相似。为了进一步证实tRNA对L1的翻译调控作用,我们检测了不同分化程度的人或鼠KC中分离的aa-tRNA对体外翻译系统中L1蛋白翻译的影响。结果表明,野生型L1 mRNA倾向于在分化的鼠KC细胞制备的裂解物中进行翻译,而优化型L1mRNA倾向于在低级分化的鼠KC细胞制备的裂解物中进行翻译。这一结果与L1转染的KC细胞中观察到的野生和优化L1蛋白的表达模式相同。这表明低级分化和完全分化的角质细胞中的aa-tRNA组成不同,因而可以不同程度的吻合HPV野生和优化型的L1 mRNA翻译的需要,从而可以调节它们在体外的翻译水平。综上所述,本研究中我们首次利用不同分化阶段的人和鼠原代角质细胞培养系统和体外翻译系统进行了L1蛋白翻译调控机制的研究。研究中首次探索了瞬时转染后的角质细胞中L1基因的转录和翻译时限,揭示了同义密码子的替换效应与细胞分化的密切关系。结果显示密码优化可以改变L1基因在细胞内的表达时效和表达模式,这种差异主要是由于分化阶段不同的角质细胞中的tRNA的组成不同,因而可以不同程度的调节野生型和优化型的L1基因的转录和翻译水平所致。所得结果为进一步阐明PV L1基因表达的分子调控机制提供了重要的实验数据和理论支持,同类研究尚未见报道。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
体外翻译系统论文参考文献
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