表达Tsol18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建及其免疫学研究

论文摘要

囊尾蚴病（Cysticercosis）是由猪带绦虫（Taenia solium）的幼虫囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,严重威胁着人体健康,不仅如此,猪囊尾蚴病的广泛存在极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行,然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。Tsol18是猪带绦虫六钩蚴（T.solium oncosphere）阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴感染中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外试验中能杀死六钩蚴,是猪囊尾蚴病疫苗研制的主要候选抗原之一。在已有的研究中,Tsol18重组蛋白在原核系统中多以包涵体形式表达,给蛋白质的复性和纯化带来许多困难,并且包涵体活性较低、保存期短、降解快,因而限制了Tsol18在猪囊尾蚴病疫苗研制上的应用。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一。为了优化猪囊尾蚴病疫苗候选抗原Tsol18重组蛋白,探索猪囊尾蚴病口服重组活载体疫苗的免疫应答,研究其在猪囊尾蚴病免疫预防上的作用,进行了本项研究。收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增Tsol18基因片段,并同义突变Tsol18基因片段中四个大肠杆菌低利用率密码子,截去其N端的16个氨基酸的信号肽编码序列,构建原核表达载体pGEX-4T-Tsol18并表达,进行GST-Tsol18重组蛋白的SDS-PAGE、Western blot及稳定性分析,并以GST-Tsol18重组蛋白为抗原制备兔高免血清;将改造的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341,构建重组载体pYA3341-Tsol18,将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶（Δasd）的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,研究重组活载体疫苗X4550（pYA3341-Tsol18）表达Tsol18重组蛋白的免疫原性、生长稳定性、口服安全性及在小鼠体内的分布情况,ELISA检测免疫小鼠血清和肠液中抗Tsol18抗体的产生情况,流式细胞术分析其脾细胞亚型的分化,ELISA检测免疫猪血清中抗Tsol18抗体的动态变化,探讨重组疫苗可能的免疫应答。结果显示改造后的GST-Tsol18重组蛋白多以可溶性形式表达,蛋白表达量占菌体总蛋白的24 %,Western blot证明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的抗原性,4℃保存120 d只有20.1 %降解,显示重组蛋白稳定性有很大改善。重组疫苗4550（pYA3341-Tsol18）在没有选择压力的情况下连续培养100代后,随机挑选的重组疫苗株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白,表明重组疫苗生长稳定;BALB/c鼠口服重组疫苗株2.0×1012 cfu 30天后,存活率100 %,证实重组疫苗口服安全可靠,小鼠口服免疫后第21天在脾脏仍能测到大量的重组疫苗株,表明重组疫苗在体内能够长久存活,有利于刺激机体产生持久的免疫应答;ELISA检测显示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18 IgG抗体的OD值达到0.645,二免后六周小鼠肠液中有抗Tsol18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种免疫应答方式;免疫小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目明显增多,CD4+/CD8+ T细胞比值也显著增高（P<0.01）,提示口服疫苗4550（pYA3341-Tsol18）可能同时诱导Th1和Th2免疫应答反应。猪免疫后20 d抗Tsol18 IgG抗体水平开始上升,在二免后30天抗体OD值达到1.025,表明重组疫苗能诱导猪产生抗猪囊尾蚴病的免疫应答效应。本研究获得了具有高效表达、良好免疫原性和稳定性的猪囊尾蚴病疫苗候选抗原GST-Tsol18重组蛋白,构建了携带Tsol18重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗4550（pYA3341-Tsol18）,初步进行了重组疫苗的免疫学研究,为猪囊尾蚴病基因工程疫苗的研制和应用开拓了新的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究的目的意义
• 1.2 国内外的研究现状
• 1.3 研究内容和方法
• 1.3.1 Tsol18 基因的克隆和优化表达
• 1.3.2 重组活载体口服疫苗的构建
• 1.3.3 重组活载体疫苗的免疫学研究
• 第二章 Tsol18 基因的克隆、优化表达及高免血清的制备
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液的配制
• 2.1.5 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 猪带绦虫虫卵的活化
• 2.2.2 六钩蚴总RNA 的提取
• 2.2.3 Tsol18 基因的RT-PCR 扩增
• 2.2.4 pGEX-4T-Tsol18 表达载体的构建
• 2.2.5 重组质粒的诱导表达
• 2.2.6 表达产物的检测
• 2.2.7 表达产物的表达形式分析
• 2.2.8 表达蛋白纯化和稳定性分析
• 2.2.9 重组蛋白Tsol18 高免血清的制备
• 2.3 结果
• 2.3.1 Tsol18 的RT-PCR 扩增
• 2.3.2 表达载体的鉴定与序列分析
• 2.3.3 表达产物的检测
• 2.3.4 表达蛋白纯化和稳定性分析
• 2.3.5 免疫兔血清的效价
• 2.4 讨论
• 2.4.1 选择Tsol18 作为免疫保护基因的原因
• 2.4.2 Tsol18 的表达形式和稳定性
• 第三章 表达 Tsol18 抗原的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 疫苗菌的构建
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要试剂和耗材
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 溶液的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 TsoL18 目的基因的制备
• 3.2.2 pYA3341-Tsol18 重组质粒的构建和筛选
• 3.2.3 pYA3341-Tsol18 重组质粒依次转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730 和X4550
• 3.2.4 4550（pYA3341-Tsol18）重组菌表达蛋白的测定
• 3.2.5 重组菌的体外稳定性试验
• 3.2.6 重组菌生长曲线的测定
• 3.2.7 重组菌的安全性试验
• 3.2.8 重组疫苗株口服免疫后在小鼠体内的分布
• 3.3 结果
• 3.3.1 Tsol18 目的基因的制备
• 3.3.2 pYA3341-Tsol18 重组质粒的鉴定
• 3.3.3 Tsol18 重组蛋白的表达及Westren blot 分析
• 3.3.3 Tsol18 重组蛋白的Westren blot 分析
• 3.3.4 重组菌X4550（pYA3341-Tsol18）的体外稳定性
• 3.3.5 重组菌生长曲线的测定
• 3.3.6 重组菌的安全性实验
• 3.3.7 重组疫苗株口服免疫后在小鼠体内的分布
• 3.4 讨论
• 第四章 重组疫苗菌 X4550（pYA3341-Tsol18）的免疫学研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 主要试剂和耗材
• 4.1.4 培养液
• 4.1.5 溶液的配制
• 4.1.6 重组菌X4550（pYA3341-Tsol18）和X4550（pYA3341）的大量制备
• 4.2 小鼠免疫实验
• 4.2.1 实验小鼠分组
• 4.2.2 实验小鼠免疫
• 4.2.3 免疫小鼠血清的收集
• 4.2.4 免疫小鼠肠道分泌性抗Tsol18 IgA 抗体的测定
• 4.2.5 免疫小鼠抗Tsol18 抗体的检测
• 4.2.6 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定
• 4.3 猪免疫实验
• 4.3.1 重组菌X4550（pYA3341-Tsol18）和X4550（pYA3341）的大量制备
• 4.3.2 实验动物的分组与口服接种
• 4.3.3 实验猪血清抗体的检测
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 ELISA 最佳条件的选择
• 4.4.2 免疫小鼠血清抗Tsol18 抗体的检测
• 4.4.3 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定
• 4.4.4 实验猪血清抗体的检测
• 4.5 讨论
• 4.5.1 寄生虫免疫逃避机制
• 4.5.2 粘膜免疫
• 4.5.3 粘膜免疫的优点
• 4.5.4 小鼠免疫实验分析
• 4.5.5 猪免疫实验分析
• 第五章 全文结论
• 第六章 文献综述减毒沙门氏菌作为口服疫苗活载体的研究进展
• 6.1 沙门氏菌减毒的相关基因
• 6.1.1 控制芳香族化合物生物合成的aro 基因
• 6.1.2 影响碳水化合物利用途径的galE 基因
• 6.1.3 pur 系列基因
• 6.1.4 asd 基因
• 6.1.5 htrA 基因
• 6.1.6 cya、crp 基因
• 6.2 减毒沙门氏菌载体激发的免疫应答
• 6.3 载体减毒沙门氏菌表达系统的构建
• 6.3.1 质粒表达系统
• 6.3.2 染色体整合系统
• 6.3.3 载体-宿主平衡致死系统
• 6.4 沙门氏菌进入机体免疫系统的机制
• 6.4.1 沙门氏菌通过粘膜上皮M 细胞进入机体
• 6.4.2 沙门氏菌被树突细胞直接从肠腔摄取进入机体
• 6.5 减毒沙门氏菌的应用
• 6.5.1 常用的减毒沙门氏菌菌株
• 6.5.2 携带DNA 疫苗的重组减毒沙门氏菌的应用
• 6.5.3 表达外源抗原的重组减毒沙门氏菌疫苗的应用
• 6.6 减毒沙门氏菌载体疫苗的优越性
• 6.6.1 抗原呈递的有效性
• 6.6.2 细菌载体的佐剂作用
• 6.6.3 细菌CpG 序列
• 6.6.4 激发粘膜免疫
• 6.6.5 减毒沙门氏菌运载效应易于强化
• 6.6.6 免疫具有持续性
• 6.6.7 抗原不需提纯
• 6.6.8 应用方便
• 6.7 潜在的危险性
• 6.7.1 弱毒细菌的危险性
• 6.7.2 质粒DNA 的危险性
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历