论文摘要
反螺旋酶（RG）首先发现于嗜热硫化叶菌,目前在所有超嗜热古菌中都发现有RG存在。通过基因组序列分析,证实它是唯一一个超嗜热生物中的特异蛋白,所以很可能RG在维持高温下基因组结构的稳定性方面发挥重要的作用。由于超嗜热古菌遗传体系的缺乏,目前对于RG的研究限于其在体外的生理生化功能方面。本课题是以本实验室分离到的一株冰岛硫化叶菌pyrEF基因自发突变株Sulfolobus islandicus E233为原始出发菌株,以尿嘧啶合成酶基因pyrEF作为筛选标记,构建RG基因的敲除质粒,并转化S.islandicus E233,利用同源重组的原理对RG基因进行敲除。这是第一次采用遗传学方法研究泉古生菌的RG基因。通过一系列实验证实,在本实验条件下,反螺旋酶基因是S.islandicus的必需功能基因,不能被敲除。本实验的研究,主要采用两种质粒构建策略进行RG基因敲除:1.首先构建基因敲除载体pRG1,转化S.islandicus E233之后,在不含尿嘧啶的选择性平板上长出了转化子。对转化子进行PCR验证,证实质粒是通过单交换的方式整合到宿主染色体上,RG基因没有被敲除。将转化子分别在非选择性培养基的平板（PVYSU双层平板）和选择性平板（PVYSU-5-FOA双层平板）上培养。从理论上讲,整合质粒能分别在两个臂基因处发生再次重组,进而脱离下来,分别产生回复突变（回复为S.islandicusE233）和RG基因缺失突变,这两者频率一致。通过平板计数,计算出回复频率为0.89%,这证实重组能够发生。PCR验证RG等位基因,发现所有重组子都是回复突变,没有RG基因缺失株。2.构建另外一个基因敲除质粒pRG pop in-pop out。该质粒能通过一次双交换整合,然后以环出的方式剪切掉。先将质粒线性化以避免任何可能通过单交换方式发生的重组。转化S.islandicus E233之后,获得了一些转化子。通过PCR的方法分析这些转化子,发现线性化的质粒并没有通过双交换的方式取代RG基因,因为RG基因仍然完整的保留在突变株中,因此pyrEF基因一定在宿主的其他位点发生整合。为了分析这些转化子究竟发生了什么变化,以转化子的总DNA为模板,利用pyrF基因内的一对特异性引物进行反向PCR（IPCR）实验。用5种不同的限制性内切酶Smi I、Sca I、Spe I、Pst I、和SnaB I对转化子总DNA进行酶切,之后分别连接酶切之后的片段,从而形成IPCR的DNA模板。实验发现5种酶切后IPCR的产物大小一致。这一结果表明,在转化子中,一定存在一个包括pyrEF基因在内的环状分子。将PCR产物进行测序分析,发现环状DNA包括pyrEF基因和右臂基因的分子。出现这一结果是因为,在缺失质粒pRG popin-pop out中,存在两个重复的右臂基因。这两个同源臂基因之间发生同源重组,将质粒环出而产生这种环状分子。所以,包括pyrEF基因和右臂基因的环状分子可能通过“整合-脱离”的方式存在于宿主中,从而能够在缺乏尿嘧啶的培养基上形成菌落。本课题的研究结果表明,采用同源重组的方法构建的两种类型的质粒,均不能实现RG基因的敲除,说明在该实验条件下,RG基因是S.islandicus的一个非常重要的功能基因,不能被敲除。这一研究结果也为研究其它类型超嗜热古菌体内的反螺旋酶的功能提供了一定理论依据。
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相关论文文献
- [1].冰岛硫化叶菌反螺旋酶基因的遗传学分析[J]. 华中农业大学学报 2009(01)
- [2].人型支原体对喹诺酮类药物耐药机制的初步研究[J]. 中国皮肤性病学杂志 2010(11)