抗菌肽Thanatin基因载体构建和表达及提高植物对菌核病抗性的研究

论文摘要

抗菌肽是生物体防御系统产生的一类对外源病菌具有高效杀灭活性的小分子多肽,在植物抗病基因工程中具有重要的应用价值。Thanatin是刺肩蝽（PodisusmacuLiventris）成虫经诱导产生的一种抗菌肽,由21个氨基酸残基组成,该抗菌肽对细菌以及真菌都有很强的抗菌活性,本研究通过转基因技术将其转入模式植物拟南芥和油菜,以提高植物的抗病性尤其是对菌核病的抗性。1 Thanatin的融合植物表达载体的构建根据GenBank登录的Thanatin序列设计引物,分别合成前端含信号肽和连接肽的基因片段,即SP-Thanatin和LP-Thanatin,分别克隆到pMD 18-T载体上。通过SP-Thanatin3’端设计了BglⅡ切点,LP-Thanatin 5’设计了Bam HI切点,利用BglⅡ和Bam HI为同尾酶的特点,LP-Thanatin Bgl-Ⅱ/BamHI双酶切片断可多轮次替换SP-Thanatin上的终止密码子（TAG）构建成可剪切多拷贝抗菌肽融合植物表达载体。结果鉴定1-5拷贝的Thanatin融合植物表达载体构建成功。2转基因油菜和拟南芥的获得通过农杆菌介导和In planta技术将1-5拷贝的Thanatin融合植物表达载体分别转化油菜和拟南芥,由于转油菜的周期长和效率低,目前我们只获得5拷贝的T0代转基因油菜,而获得了1-5拷贝的全部转基因T0代拟南芥,对转基因油菜和拟南芥进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因植株中并无预期中的高抗菌核病类型。3 Thanatin的亚细胞定位和原核表达构建SP-Thanatin-GFP融合基因,利用基因枪轰击洋葱表皮。洋葱表皮细胞瞬时表达融合蛋白,在荧光显微镜下观察显示荧光蛋白特异性地定位于细胞间隙,表明信号肽能成功的将目的蛋白引导到细胞外。同时构建Thanatin的原核表达载体pGEX-Thanatin,诱导表达后经12%SDS-PAGE分析,显示在约36KD处有特异性条带,证明Thanatin能在大肠杆菌中表达且效果良好。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 1.核盘菌及菌核病的研究
• 1.1 菌核病的症状
• 1.2 核盘菌的形态特征
• 1.2.1 菌丝
• 1.2.2 菌核
• 1.2.3 子囊盘
• 1.3 核盘菌的寄主范围
• 1.4 核盘菌的侵染循环
• 1.5 致病机理
• 1.5.1 草酸的致病机理
• 1.5.2 酶的致病机理
• 1.6 菌核病的防治
• 1.6.1 农业防治
• 1.6.2 化学防治
• 1.6.3 生物防治
• 1.6.4 抗病品种的应用
• 1.6.5 转基因工程方法
• 2 抗菌肽及其在植物抗病基因工程中的应用
• 2.1 抗菌肽的分类
• 2.1.1 防御素:
• 2.1.2 昆虫抗菌肽:
• 2.2 抗菌肽的理化特性
• 2.3 抗菌肽的结构特征
• 2.4 抗菌肽的作用机制
• 2.4.1 抗菌作用机制
• 2.4.2 抗病毒作用机制
• 2.4.3 抗寄生虫作用机制
• 2.4.4 抗肿瘤细胞及癌实体瘤的作用机制、
• 2.5 应用前景
• 2.6 抗菌肽的开发应用难点
• 引言
• 材料与方法
• 1 供试材料
• 1.1 菌种和载体
• 1.2 植物材料:
• 1.3 试剂
• 1.4 培养基
• 1.5 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 Thanatin的融合植物表达载体的构建
• 2.1.1 载体构建策略
• 2.1.2 Thanatin基因串联体的构建
• 2.1.3 Thanatin基因串联体植物表达载体的构建
• 2.2 转基因油菜和拟南芥的获得及其菌核病抗性分析
• 2.2.1 载体质粒转入农杆菌感受态细胞
• 2.2.3 重组转化子的鉴定
• 2.2.4 农杆菌的培养
• 2.2.5 油菜转化
• 2.2.6 拟南芥的种植、转化及转化植株的筛选
• 2.2.7 转基因植株的PCR鉴定
• 0代抗病性的初步测定'>2.2.8 转基因油菜和拟南芥T₀代抗病性的初步测定
• 2.3 Thanatin的亚细胞定位和原核表达
• 2.3.1 构建SP-Thanatin与GFP融合基因。
• 2.3.2 基因枪（PDS-1000/He）轰击洋葱表皮
• 2.3.3 GFP绿色荧光观察
• 2.3.4 Thanatin基因原核表达载体构建
• 2.3.5 融合蛋白表达
• 结果与分析
• 1 Thanatin的融合植物表达载体的构建
• 1.1 含Thanatin基因各片段的扩增
• 1.2 SP-Thanatin和LP-Thanatin的TA克隆与鉴定
• 1.3 Thanatin基因串联体的构建及鉴定
• 1.4 Thanatin基因串联植物表达载体的构建及鉴定
• 2 转基因油菜和拟南芥的获得及其菌核病抗性分析
• 2.1 转化子PCR鉴定
• 2.2 油菜外植体的培养
• 2.3 转基因油菜的获得
• 2.4 转基因拟南芥的获得
• 0代转基因植株PCR鉴定'>2.5 T₀代转基因植株PCR鉴定
• 2.6 抗病性鉴定
• 3 Thanatin的亚细胞定位和原核表达
• 3.1 载体的构建
• 3.2 载体质粒的PCR鉴定
• 3.3 Thanatin与GFP融合蛋白的亚细胞定位观察
• 3.4 融合蛋白表达
• 讨论
• 1 Thanatin的融合植物表达载体的构建
• 2 转基因油菜和拟南芥的获得及其菌核病抗性分析
• 2.1 农杆菌转化的机制
• 2.2 转化受体的选择和影响因子
• 2.3 试管苗的玻璃化现象
• 2.4 关于拟南芥转化条件的优化
• 2.5 抗性鉴定
• 3 Thanatin的亚细胞定位和原核表达
• 3.1 Thanatin与GFP融合蛋白的亚细胞定位观察
• 3.2 信号肽的应用
• 3.3 Thanatin的原核表达
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录A PFGC5941图谱
• 附录B PGEX-4T-1图谱
• 附录C PMD18-T图谱
• 附录D 缩略词表
• 附录E 主要化学试剂及缓冲液配制
• 附录F 培养基配方
• 致谢
• 作者简介