论文摘要
随着化学农药环境污染问题的凸显,环境友好型生物农药越来越受到青睐。生物农药的主体为微生物农药,目前全球有约225种微生物农药在超过30个国家生产使用,年销售额已达10亿美元,且每年还以10%左右的速度增长。微生物杀虫剂占了微生物农药产品的90%以上,其中己报道的细菌杀虫剂150多种,真菌杀虫剂800多种,昆虫病毒杀虫剂1600多种,典型代表分别为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiersis, Bt）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana, Bb）和棉铃虫核型多角体病毒（Helicoverpa armigeranucleopolyhedrovirus, HaNPV）。微生物农药较化学农药具有环境相容性好的特点,是农业病虫害防治手段的发展方向,目前施用面积占总防治面积的10-15%。但微生物农药的大量或不合适使用也会带来不同于化学农药的环境安全性风险。为了评估这种风险,美国、日本等发达国家已建立了相关检验导则用于指导微生物农药在本国登记前的安全性测试。但截止目前,我国尚缺乏类似导则。为此,本文选择我国目前大量使用的几种典型微生物农药为研究对象,以我国广泛分布的家蚕和蜜蜂品种-二化性四眠家蚕（苏菊×明虎）和意大利蜜蜂、中华蜜蜂为靶标昆虫,借鉴国外微生物农药安全性评价经验并加以改进,从侵染性、毒性作用和影响毒性作用的因素三个方面开展了典型微生物农药对家蚕安全性测试研究以及对蜜蜂测试的初探,为建立一套适用于我国实际的敏感实用微生物农药安全性检验方法提供依据。主要研究结果如下：1、利用实时荧光定量PCR方法检测了典型微生物农药侵染家蚕后的增殖能力。证明Bb不仅能够侵染家蚕,也能在家蚕体内增殖,且其增殖能力随接种浓度提高而增强。用1××1008,1×1009和1××1010个/ml接种家蚕,接种后3天家蚕体内的Bb18S rRNA基因拷贝数较第1天分别提高8、20和37倍。HaNPV也能侵染家蚕,并在家蚕体内增殖,用HaNPV （1×109多角体/m1）经口暴露接种2龄家蚕,死亡家蚕体内的HaNPV基因拷贝数较发病前提高了3.4倍；在未死亡的家蚕体内表现出消减,基因拷贝数较接种水平下降了48倍。1×1×08芽孢/ml Bt经口暴露给5龄家蚕未发生侵染,发现其在中肠消化液中消减迅速,2d后cry Ⅰ基因拷贝数下降了34倍。2、典型微生物农药对家蚕的急性毒性、慢性毒性和亚致死效应研究结果表明：三种典型微生物农药Bt、Bb和HaNPV均对2龄家蚕有急性毒性作用,LG50分别为1.44×108芽孢/m1、4.64×10109分生孢子/ml以及2.62××108多角体/ml。Bt、Bb和HaNPV对家蚕的亚致死效应会表现在生长发育和免疫反应方面,体重、蜕皮率和酚氧化酶活性可作为敏感指标进行早期诊断。Bt对家蚕的慢性毒性不影响全茧重、茧层重、茧层率、产卵数等反映家蚕产茧能力和繁殖能力的指标。3、典型微生物农药对蜜蜂的急性毒性作用表明,在最大风险浓度下,Bb对意大利蜜蜂和我国本地物种-中华蜜蜂均可侵染致死,而Bt、HaNPV对两种蜜蜂均未表现出不良影响。4、虫龄、环境条件严重影响典型微生物农药对环境昆虫的毒性作用。家蚕虫龄越大,对Bt、Bb和HaNPV的敏感性越小,表现在死亡率、眠蚕体重、蜕皮率均较低。环境条件也会影响微生物农药对靶标昆虫的毒性作用,其中温度显著影响Bb对蜜蜂的致死率,在34℃（蜂巢内温度）下的致死率约为26℃的1/3；而湿度则严重影响Bb对家蚕的毒性,高湿度（95%RH）下的LC50是中等湿度（80%RH）下的LC50的1/30。根据以上研究结果,我们提出了从侵染性和毒性作用两个方面来进行微生物农药对家蚕、蜜蜂的安全性评价建议,并认为可通过实时荧光定量PCR检测微生物农药的增殖能力来研究其侵染性；在急性毒性测试的基础上,通过体重、蜕皮率和酚氧化酶活性这些亚致死效应敏感指标进行微生物农药对家蚕安全性的早期诊断。此外,环境因子严重影响微生物农药的安全性评价,选择适宜的环境条件对评价微生物农药对家蚕、蜜蜂的安全性至关重要。