论文摘要
目的:观察动脉粥样硬化形成过程中血浆Hsp70水平的变化规律,研究血浆Hsp70的来源及其产生机制,探索血浆Hsp70在心血管疾病发生中的作用。为揭示动脉粥样硬化的发病机制,探寻动脉粥样硬化防治的预警分子提供新的科学依据。方法:为认识动脉粥样硬化形成过程中血浆Hsp70水平的变化规律,采用高脂膳食方法建立大鼠动脉粥样硬化模型,采用生化方法与病理学方法观察血脂水平及动脉血管损伤情况,采用高压液相方法检测血浆Hcy水平,以确定动脉粥样硬化的建立;采用双抗夹心ELISA方法检测大鼠动脉粥样硬化形成过程中血浆Hsp70水平,分析血浆Hsp70水平变化规律及其与动脉粥样硬化发生发展的相关性,并采用免疫组化方法检测动脉粥样硬化形成过程中血管壁Hsp70的含量变化;为探索血浆Hsp70的来源及其产生的机制,采用动脉粥样硬化危险因素Ox-LDL与Hcy处理血管内皮细胞,采用生化方法及ELISA方法观察细胞内Hsp70向培养液中释放的情况及其与细胞损伤的关系;为揭示细胞内Hsp70表达变化对Hsp70向胞外释放的影响,采用免疫印迹及凝胶阻滞电泳方法检测Ox-LDL或Hcy对血管内皮细胞Hsp70表达的影响,观察ERK1/2信号传导通路的活化情况及其对Hsp70表达的调控作用;为进一步明确血管内皮细胞释放Hsp70的细胞学途径,采用非连续密度超速离心及四步离心法分离脂筏与外来体,采用免疫印迹方法检测脂筏与外来体中Hsp70的含量,以确定血管内皮细胞释放Hsp70的依赖途径;为初步了解血浆Hsp70对动脉粥样硬化形成的影响,采用ELISA方法观察细胞外Hsp70对血管内皮细胞及血液细胞产生粘附因子和炎症因子的影响,并应用淋巴细胞粘附实验观察血管内皮细胞与淋巴细胞粘附情况,以确认细胞外Hsp70在血管损伤中的生物学作用。结果:通过整体动物实验认识动脉粥样硬化形成过程中血浆Hsp70的变化规律。研究发现,高脂组大鼠高脂膳食2周后大鼠血浆总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）水平较对照组显著升高,且随着疾病的发生发展呈现逐步升高的趋势。大鼠主动脉病理学检查显示,高脂膳食组大鼠血管壁内膜增厚,内膜下有脂质沉积形成的空泡,膜间隙增大,平滑肌细胞增生,细胞排列紊乱,形成片状或点状钙化的动脉粥样硬化斑块;对血浆Hsp70水平的检测结果显示,高脂组大鼠高脂膳食4周后大鼠血浆Hsp70水平较对照组显著升高,并随着动脉粥样硬化的发生发展出现逐渐升高的趋势;血浆Hsp70水平的变化与动脉粥样硬化的严重程度密切相关,并与血浆中动脉粥样硬化危险因素LDL或Hcy水平的变化具有正相关关系;免疫组化结果显示动脉粥样硬化损伤区域Hsp70含量较正常区域明显增多,在斑块病灶区域Hsp70高度浓集。通过细胞学实验研究血浆Hsp70的来源及其释放机制,给予血管内皮细胞不同浓度的Ox-LDL或Hcy作用不同的时间,结果发现,当细胞未出现损伤时培养液中Hsp70水平即出现明显升高,当细胞损伤出现时培养液中Hsp70水平升高更为明显,表明Ox-LDL或Hcy可通过被动和主动方式诱导血管内皮细胞释放Hsp70;Ox-LDL或Hcy可通过上调血管内皮细胞Hsp70表达而促进Hsp70释放,ERK1/2信号传导通路是介导Ox-LDL或Hcy调控Hsp70表达的分子机制;进一步对Hsp70释放途径的研究发现,Ox-LDL或Hcy诱导血管内皮细胞主动释放Hsp70不依赖于经典分泌途径,也不是脂筏途径,结果显示,Ox-LDL或Hcy可增加血管内皮细胞释放外来体的数量,且外来体中Hsp70含量明显增多,表明外来体可能是血管内皮细胞主动释放Hsp70的途径。在血浆Hsp70对动脉粥样硬化病程影响的初步探索中发现,细胞外Hsp70对血管内皮细胞无直接损伤作用,对其ICAM-1的表达也无影响,但细胞外Hsp70可通过诱导血液淋巴细胞释放IL-6引发炎症反应,并促进淋巴细胞与血管内皮细胞的粘附,从而参与动脉粥样硬化的发病过程。结论:高脂膳食所致大鼠动脉粥样硬化形成过程中,血浆Hsp70水平呈现逐渐升高的变化规律,并与动脉粥样硬化病程的发展以及血浆TC和LDL水平具有密切关系,血浆Hsp70可能作为标志动脉粥样硬化发生的预警指标。血浆Hsp70升高的重要原因是Ox-LDL与Hcy通过激活ERK1/2信号通路上调血管内皮细胞Hsp70表达,并通过主动与被动的方式导致血管内皮细胞Hsp70释放增多,外来体可能是血管内皮细胞主动释放Hsp70的途径。血浆Hsp70可能通过刺激淋巴细胞炎症反应参与动脉粥样硬化的发生发展过程。