猪繁殖与呼吸综合征病毒HLJ-09株的分离鉴定和全基因组分析

论文摘要

从河南某发病猪场采集病料,分离得到一株PRRSV,对其进行分离鉴定、动物试验和全基因测序,并与国内外的其他毒株引起的组织学变化比较和全序列比对分析,研究PRRSV致病力、遗传变异情况以及分子生物学特征,研究的主要内容如下:1.将采集到的肺脏、肾、淋巴结等病料进行研磨滤过处理,接种到Marc-145细胞,盲传3代后,出现明显的CPE,经RT-PCR方法鉴定分离到的病毒为PRRSV,将其命名为PRRSV HLJ-09,对HLJ-09进行TCID50测定,TCID50结果为10-6.5。2.利用分离的细胞毒和组织毒进行SPF猪攻毒实验,观察攻毒后仔猪的临床反应,并记录体温变化;对病死猪进行剖检,观察剖检病变;然后采集主要组织器官,进行固定、切片、HE染色,光学显微镜下观察;同时肺组织进行超薄切片,在电子显微镜下观察病毒粒子。电镜结果显示,该变异株与以前的毒株在形态和大小上基本无差别;病理组织切片结果显示,机体的各个组织器官均出现了典型的病理变化,如脑的神经细胞空泡化和“嗜神经”现象、心肌炎、肾小管“管型”、淋巴结出现了典型的“星空样变”等。与以前的报道的毒株相比,各个组织和器官的病理变化要严重,推测高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒HLJ-09引起的严重病理损伤是其高死亡率的原因。3.根据VR-2332和JXA1序列分段设计9对引物,采用Marc-145细胞增殖的细胞病毒提取RNA,应用RT-PCR方法扩增PRRSV HLJ-09的9个片段,根据片段之间的重叠区域,用DNAStar将正反向测序成功的各序列拼接,获得HLJ-09毒株的全基因序列,然后将其与GenBank中近几年国内外的典型毒株的基因序列进行比对分析,构建系统进化树,分析HLJ-09的遗传变异情况及分子生物学特征。结果表明:HLJ-09与欧洲型毒株的差异较大,与LV的核苷酸相似性仅为61.6%;与2006年分离的JXA1、CH-la、HEB1等国内分离的美洲型毒株相比存在一定的差异,核苷酸相似性在94.8%98.9%之间,与2006年以后国内分离的PRRSV毒株相比,核苷酸相似性保持在97.1%以上;推导氨基酸的相似性与JXA1相比仅为97.1%,与BJ-4相比为75.8%。HLJ-09符合高致病性PRRSV的分子特征, PRRSV毒力相关9个氨基酸,HLJ-09在这些位点上与高致病性PRRSV的保持一致。PRRSV HLJ-09株与国内流行的其他毒株相比,基因组序列未发现明显变异。本实验对分离的高致病性PRRSV毒株HLJ-09进行了动物试验、全长测序及比对分析,使我们对PRRSVHLJ-09的来源、致病力及进化方向有所了解,为PRRS的防控提供了参考资料;同时丰富了PRRSV基因库,为以后更加深入研究PRRSV基因功能,探索PRRSV致病的分子机制,以及诊断试剂盒研发和基因工程苗的研制有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪呼吸与繁殖综合征病毒研究进展
• 1.1 PRRS 概述
• 1.1.1 PRRS 的危害
• 1.1.2 PRRS 的流行病学
• 1.1.3 PRRS 的临床症状
• 1.1.4 PRRS 的诊断研究
• 1.2 PRRS 病原学研究
• 1.2.1 PRRS 的病原和分类
• 1.2.2 PRRSV 形态特征及基本特性
• 1.2.3 PRRSV 的分离培养特性
• 1.3 PRRSV 的分子生物学研究
• 1.3.1 高致病性PRRSV 的分子特征
• 1.3.2 PRRSV 的复制及基因的转录和表达
• 1.3.3 PRRSV 非编码区5’UTR 和3’UTR
• 1.3.4 PRRSV 的蛋白质
• 1.3.5 PRRSV 的基因组变异和RNA 重组
• 1.4 国内PRRS 疫苗
• 1.5 在中国PRRS 的控制和前景
• 1.6 研究目的与意义
• 实验研究
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征HLJ-09 株的分离与鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验病料
• 2.1.2 细胞
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试验仪器
• 2.1.5 试验相关试剂的配制
• 2.1.6 引物设计
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 病料的采集及处理
• 2.2.2 病毒RNA 的提取
• 2.2.3 RNA 的反转录
• 2.2.4 PCR 反应
• 2.2.5 细胞的复苏与培养
• 2.2.6 病毒分离培养
• 2.2.7 TCID50 测定
• 2.2.8 细胞毒抗原检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 外源 PRRSV 检测
• 2.3.2 TCID50 测定结果
• 2.3.3 细胞毒PCR 检测结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 PRRSV HLJ-09 株对仔猪的人工感染
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验病料
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 实验仪器
• 3.1.5 试验试剂的配置
• 3.2 方法
• 3.2.1 分圈编号
• 3.2.2 采血和抗原抗体检测
• 3.2.3 仔猪感染
• 3.2.4 临床症状
• 3.2.5 死猪剖检和组织采集
• 3.2.6 组织病理切片制备
• 3.2.7 电镜标本的制备
• 3.3 结果
• 3.3.1 抗原检测结果
• 3.3.2 抗体检测结果
• 3.3.3 临床症状
• 3.3.4 组织切片观察
• 3.3.5 电镜观察
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒HLJ-09 株全基因组序列分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 引物设计
• 4.1.3 病料RT-PCR 检测
• 4.1.4 细胞毒RT-PCR
• 4.1.5 序列测定与分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 目的基因的扩增
• 4.2.2 全基因组片段的测定及序列相似性分析
• 4.2.3 遗传进化树分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 英文缩略词及中英文对照
• 致谢
• 作者简介