石油烃厌氧降解菌的筛选及其降解特性研究

论文摘要

近年来,石油污染对环境、人类的生产和生活造成了严重的影响,石油污染的治理,特别是土壤和地下水的生物修复技术已经成为了研究热点。生物修复技术包括原位和异位生物修复,对于石油污染源比较分散的土壤和地下水环境,采用原位生物修复具有明显的优势,由于土壤和地下水的缺氧特性,特别是在高温干旱等极端环境下,使得原位厌氧生物修成为可能。本文首先通过分析16个月原位强化修复石油污染土壤的理化性质和纵向分布特征,探讨厌氧降解在原位修复过程中的作用;其次,采集克拉玛依油田的污染土壤样品,选择合适的电子受体,筛选土著嗜热石油烃厌氧降解菌,并对可培养的单菌进行了分子生物学鉴定,确定了厌氧降解混合菌KLA14-2的最佳培养条件;对混合菌KLA14-2进行环境影响因素考察,分析两种不同性质原油的降解特性;最后,在底物降解范围和群落结构稳定性研究的基础上,选择单环芳烃甲苯和多环芳烃萘为模式物,考察KLA14-2对甲苯和萘的降解特性,利用紫外、红外和GC-MS等方法对甲苯和萘代谢产物进行了分析,推测可能的代谢途径,得到以下几个结论:（1）经16个月原位强化修复后各土层的石油烃得到一定程度的去除,表层土饱和分和芳香分去除率最高;底层土IN-1处于缺氧环境,存在硫酸盐还原和反硝化作用,使得土壤pH值从7.86±0.03降低至7.27±0.03,土壤总氮从2.53±0.13g/kg降低至0.77±0.04 g/kg;厌氧菌数量与胶质和沥青质去除率之间成正相关关系,对于污染源较为分散的污染区域,采用原位生物强化修复时可以考虑引入厌氧修复;（2）克拉玛依石油污染土壤硫酸盐含量丰富,硫酸盐适合做为石油烃厌氧降解菌的电子受体;经过初筛和复筛,得到一组稳定、降解效果较好的厌氧降解混合菌KLA14-2;经多次分离、纯化共获得四株可培养厌氧单菌,分子鉴定表明KLA14-2-1和KLA14-2-3分别属于地衣芽胞杆菌属（Bacillus licheniformis）和热嗜淀粉芽孢杆菌属（Bacillus thermoamylovorans）,而KLA14-2-2和KLA14-2-4只能初步判断分别与可培养的脱硫肠状菌属（Desulfotomaculum）和铁细菌的亲缘关系较近,4株单菌的原油降解能力均较差,混合菌对原油的降解具有优势;（3）过低的接种量不利于KLA14-2降解原油,最佳接种量为2%;混合菌可以在5060℃的温度下保持较好的原油降解能力,最适pH值范围为68,低于CMC浓度的表面活性剂（50mg/L）可以一定程度上促进混合菌KLA14-2对原油的降解;硫酸盐还原作用对厌氧降解原油的贡献最大,在三种电子受体共同存在时,三价铁能够促进厌氧降解混合菌KLA14-2的降解,硝酸根会抑制KLA14-2的降解;KLA14-2对不同性质原油具有不同的降解特性,能够利用稠油中的胶质等难降解组分;（4）混合菌的底物利用能力要强于单菌,其中混合菌KLA14-2对低浓度的8种石油烃化合物均具有较好的利用能力;PCR-ARDRA分析结果表明KLA14-2种群结构复杂,可培养和分离的微生物只占到了21.1%;在原油条件下,混合菌KLA14-2的群落结构变得更加简单,优势菌的种类发生变化,含量也由63.75%提高到73.75%;（5）混合菌KLA14-2对萘的耐受能力要差于甲苯,萘和甲苯的厌氧降解符合非竞争性底物抑制模型,各种混合电子受体条件下KLA14-2对甲苯和萘的降解能力普遍好于单一的电子受体,一定量的外加碳酸氢盐可加速萘的降解进程,对甲苯影响不大;（6）KLAL14-2厌氧降解甲苯主要代谢机理为苯甲基琥珀酸盐合成反应和苯甲酸盐合成反应,代谢产物有苯甲基琥珀酸和苯甲酸;厌氧降解萘的主要代谢机理为羧基化反应和甲基化反应,主要代谢中间产物有2-萘酸、萘基-2-甲基琥珀酸、5,6,7,8-四氢-2-萘酸、十氢萘酸、cis-2-羧基环已醋酸等。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文创新点摘要
• 第一章 引言
• 1.1 国内外研究现状
• 1.1.1 石油污染的产生和危害
• 1.1.2 石油烃污染的厌氧生物修复技术研究
• 1.1.3 石油烃厌氧降解菌
• 1.1.4 石油烃的微生物厌氧降解机制
• 1.2 课题研究的意义和主要内容
• 1.2.1 课题研究意义
• 1.2.2 课题研究的主要内容和技术路线
• 第二章 厌氧降解对石油污染土壤原位强化生物修复的影响
• 2.1 主要设备与试剂
• 2.1.1 主要实验设备
• 2.1.2 实验药品及试剂
• 2.1.3 实验所用的培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 土壤样品的采集与保存
• 2.2.2 土壤理化性质测定
• 2.2.3 土壤中含油率的测定
• 2.2.4 污染土层微生物种群数量的测定
• 2.2.5 土样石油烃柱层析及正构烷烃组分分析
• 2.2.6 数据处理与统计
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 土壤理化性质纵向分布
• 2.3.2 土壤微生物特性纵向分布
• 2.3.3 土层石油烃及其组成纵向分布特征
• 2.4 小结
• 第三章 石油烃厌氧降解菌的筛选、鉴定及培养条件优化
• 3.1 主要设备与试剂
• 3.1.1 主要实验设备
• 3.1.2 实验药品及试剂
• 3.1.3 实验所用的培养基
• 3.1.4 样品采集
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 厌氧降解菌电子受体的选择
• 3.2.2 培养基的配制
• 3.2.3 石油烃降解菌的初筛
• 3.2.4 石油烃降解菌的复筛
• 3.2.5 石油烃降解率的测定
• 3.2.6 石油烃厌氧降解菌的分离、纯化及降解能力测定
• 3.2.7 石油烃厌氧降解混合菌群落结构的初步分析
• 3.2.8 石油烃厌氧降解混合菌的最优培养条件考察
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 厌氧降解菌电子受体的选择
• 3.3.2 石油烃厌氧降解菌的初筛
• 3.3.3 石油烃降解菌的复筛
• 3.3.4 石油烃厌氧降解菌的分离、纯化及降解能力测定
• 3.3.5 石油烃厌氧降解混合菌群落结构的初步分析
• 3.3.6 石油烃厌氧降解混合菌的最优培养条件考察
• 3.4 小结
• 第四章 混合菌KLA14-2降解原油的影响因素及其降解特性研究
• 4.1 主要设备与试剂
• 4.1.1 主要实验设备
• 4.1.2 实验药品及试剂
• 4.1.3 实验所用的培养基
• 4.1.4 菌源
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 环境因素对厌氧降解菌降解原油的影响
• 4.2.2 石油烃厌氧降解菌降解原油的降解特性
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 环境因素对厌氧降解混合菌KLA14-2 降解石油烃的影响
• 4.3.2 厌氧降解混合菌KLA14-2 对原油降解特性分析
• 4.4 小结
• 第五章 石油烃厌氧降解菌的底物降解范围和群落结构稳定性
• 5.1 主要设备与试剂
• 5.1.1 主要实验设备
• 5.1.2 实验药品及试剂
• 5.1.3 实验所用的培养基
• 5.1.4 菌源
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 降解混合菌的底物利用范围实验方法
• 5.2.2 不同底物条件下厌氧降解菌KLA14-2 群落结构的变化
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 厌氧降解混合菌及单菌在不同底物上的生长情况
• 5.3.2 混合菌KLA14-2 在不同浓度的不同底物下的生长情况
• 5.3.3 不同底物条件下厌氧降解菌KLA14-2 群落结构的变化
• 5.4 小结
• 第六章 厌氧降解混合菌KLA14-2对芳烃的降解特性及代谢途径分析
• 6.1 主要设备与试剂
• 6.1.1 主要实验设备
• 6.1.2 实验药品及试剂
• 6.1.3 实验所用的培养基
• 6.1.4 菌源
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 甲苯和萘的测定方法
• 6.2.2 甲苯和萘的萃取方法
• 6.2.3 厌氧管密闭性及非生物降解对甲苯和萘的影响
• 6.2.4 KLA14-2 对甲苯和萘的降解特性
• 6.2.5 厌氧降解混合菌KLA14-2 降解芳烃的代谢途径
• 6.3 实验结果与讨论
• 6.3.1 气相色谱法测定甲苯和萘的标准曲线和回收率
• 6.3.2 厌氧管密闭性及非生物降解对甲苯和萘的影响
• 6.3.3 不同浓度的甲苯和萘对KLA14-2 厌氧降解的影响
• 6.3.4 不同电子受体对KLA14-2 厌氧降解甲苯和萘的影响
• 6.3.5 硫酸盐还原条件下甲苯和萘的相互存在对KLA14-2 厌氧降解的影响
• 6.3.6 碳酸氢盐对甲苯和萘厌氧降解的影响
• 6.3.7 厌氧降解混合菌KLA14-2 降解芳烃的代谢途径
• 6.4 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简介