大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）孢子囊形成过程的基因差异表达研究

论文摘要

本研究为了寻找一种获得大豆疫霉菌纯营养菌丝的方法,以玻璃纸胡萝卜琼脂培养大豆疫霉菌,利用mRNA差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）技术研究大豆疫霉菌在无菌水诱导孢子囊形成早期（0～7h）的基因差异表达谱,通过反Northern杂交、克隆、测序、同源比较及功能分析,初步明确了孢子囊形成过程的调控基因,为从转录水平调控孢子囊的形成打下理论基础,从而为控制大豆疫霉菌侵染和危害提供一定的依据。研究结果表明:玻璃纸胡萝卜琼脂培养大豆疫霉菌能获得纯营养菌丝,3h换一次无菌水诱导纯营养菌丝,7h开始产生孢子囊;试验确定了大豆疫霉菌DDRT-PCR的优化体系,筛选出30对引物组合,共得到了稳定的差异条带90条;反Northern杂交验证出阳性差异片段39条,假阳性率为56.7%;克隆测序后获得36条差异片段序列,在Genbank数据库中进行Blast同源比对,结果发现有9条差异片段不存在与之匹配的同源序列,其余27条差异片段与大豆疫霉菌、致病疫霉菌、芸苔根肿菌和烟草黑胫病菌中已克隆到的许多与抗逆、菌丝及孢子生长、侵染、繁殖等有关的EST具有很高的同源性,27条差异片段中只有9条与已知基因和蛋白序列具有同源性。差异片段AR7-296和GR7-292与长醇磷酸甘露糖转移酶EDL06543.1同源性达到74%,推测其可能编码长醇磷酸甘露糖转移酶,与细胞壁的形成有关,调控甘露糖的转化,为细胞壁的形成提供供体;差异片段GR19-312与拟南芥自体吞噬3基因NM125543.3同源性为80%,推测其可能编码自体吞噬蛋白基因,参与大豆疫霉菌自体吞噬过程,为菌丝顶端生长和孢子囊的形成提供能量;差异片段CR15-282与热带爪蟾Rab5基因NM001030328.2同源性为75%,推测其可能编码Rab5基因,调节泡囊的形成,为菌丝顶端生长和孢子囊的生成提供泡囊;差异片段CR15-290与假定的衰老相关蛋白BAB33421.1有70%的同源性,推测其可能编码衰老相关蛋白,通过E3泛素连接酶调控大豆疫霉菌的衰老过程。差异片段GR1-373与二酰基甘油酰基转移酶XP821103.1有36%同源性,推测其可能参与了油脂的合成;差异片段AR15-258与ABC载体蛋白XP643503.1有30%的同源性,推测其可能与有毒代谢物运出细胞外有关;差异片段CR4-289与核糖核蛋白体结合蛋白基因XM001654574.1同源性为83%,推测其可能编码核糖核蛋白体结合蛋白基因,但该蛋白的具体功能未查到;差异片段GR19-366与假定蛋白基因XP001618281.1有72%的同源性,推测其可能编码假定蛋白,但该蛋白的具体功能也未查到。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 大豆疫霉根腐病的发生与危害
• 1.2 大豆疫霉菌的研究进展
• 1.2.1 大豆疫霉菌的分类地位
• 1.2.2 大豆疫霉菌的生理小种
• 1.2.3 大豆疫霉菌的形态特征和生物学特性
• 1.2.4 大豆疫霉菌卵孢子萌发的研究
• 1.2.5 大豆疫霉菌孢子囊诱导的研究
• 1.3 疫霉菌的基因组与功能基因组学
• 1.3.1 疫霉菌基因组
• 1.3.2 基因组的不稳定性
• 1.3.3 疫霉菌功能基因组学
• 1.4 mRNA差异显示技术及其研究概况
• 1.4.1 mRNA差异显示技术的原理及步骤
• 1.4.2 mRNA差异显示技术的优缺点
• 1.4.3 mRNA差异显示技术的改进方法
• 1.4.4 mRNA差异显示技术的衍生技术
• 1.4.5 mRNA差异显示在植物病理学方面的应用
• 1.5 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 供试病原菌
• 2.1.2 供试培养基
• 2.1.3 试验所用药剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 大豆疫霉菌的培养
• 2.2.2 大豆疫霉菌卵孢子的检测
• 2.2.3 大豆疫霉菌游动孢子囊产生时间的检测
• 2.2.4 取样
• 2.2.5 RNA的提取
• 2.2.6 cDNA第一链的合成
• 2.2.7 差异显示PCR反应
• 2.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色
• 2.2.9 差异片段回收及再扩增
• 2.2.10 反向Northern杂交
• 2.2.11 阳性差异片段的克隆
• 2.2.12 差异片段测序及序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 纯营养菌丝的获得取样时间的确定
• 3.2 RNA的提取
• 3.3 cDNA的合成
• 3.4 差异显示PCR扩增条件的优化
• 3.5 DDRT-PCR引物的筛选及差异条带的获得
• 3.5.1 引物的筛选
• 3.5.2 差异条带的获得
• 3.6 差异条带的回收与二次扩增
• 3.7 反Northern杂交
• 3.8 阳性差异片段的克隆
• 3.9 差异片段的测序与分析
• 4 讨论
• 4.1 DDRT-PCR对实验材料的要求
• 4.2 DDRT-PCR技术操作的注意事项
• 4.3 mRNA差异显示过程中一些问题的探讨
• 4.3.1 总RNA的提取与反转录
• 4.3.2 引物组合的筛选
• 4.3.3 PCR产物克隆及测序
• 4.3.4 关于真假阳性的鉴定
• 4.4 差异片段与生长发育的关系
• 4.4.1 参与细胞壁的形成
• 4.4.2 参与自体吞噬过程
• 4.4.3 参与泡囊的形成
• 4.4.4 与衰老过程有关
• 4.4.5 参与油脂的合成
• 4.4.6 参与了有毒代谢物的排出细胞过程
• 4.4.7 未知功能差异片段的探讨
• 4.5 展望
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文