毛细管电泳法应用于培养基及发酵液成分测定的研究

论文摘要

代谢工程是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络、并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰,进而完成细胞特性改造的应用性学科。代谢流是代谢途径的量化,它不仅解决代谢过程中物质的来源于去处问题,更强调其精确的时间性和数量关系。它是代谢工程研究的基础。代谢流研究要求培养基的成分和含量准确稳定。培养基中最重要用量最大的是碳源和氮源。目前对培养基碳源和氮源的定量方法有很多不足,限制了他们的应用。为进行代谢流研究,必须建立灵敏、准确、稳定、专一的碳源、氮源定量检测的方法。 本论文建立了一系列糖和氨基酸的毛细管电泳（CE）分析方法并进行了方法学研究,初步将这些方法用于发酵液的分析,分别测定发酵液中糖和游离氨基酸的含量。结果表明毛细管电泳可以快速、准确、专一的进行糖和氨基酸的定性定量分析。其分离、定量分析范围及测定结果可用于微生物的代谢流研究。 本实验以硼砂-SDS—Tris为缓冲液的毛细管电泳法测定经PITC衍生的氨基酸,取得了很好的分离效果。对此法的硼砂浓度、pH、SDS浓度、Tris浓度、电压、温度等参数进行优化获得最佳分离条件,这一方法可用于杆菌肽发酵液中氨基酸的含量测定。 对于糖的毛细管电泳分析,分别采用了间接法和衍生法,经比较发现非还原糖以硼砂缓冲体系间接紫外检测效果较好,还原糖根据浓度不同可选用a-萘氨和DHZ衍生两种方式检测。本实验对间接紫外测定非还原糖和DHZ衍生测定还原糖的方法进行了条件摸索和优化,并应用于杆菌肽发酵液中糖类的测定,取得了很好的结果。

论文目录

• 英文缩写说明
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1.代谢工程与代谢流分析
• 1.1.1.代谢工程及其研究进展
• 1.1.2.代谢网络与代谢流
• 1.1.3.代谢流研究存在的问题
• 1.1.4.代谢工程研究展望
• 1.2.培养基——代谢工程研究的基础之一
• 1.2.1.研究分析培养基成分的意义
• 1.2.2.培养基的分类及其功用
• 1.2.2.1.碳源
• 1.2.2.2.氮源
• 1.2.2.3.无机盐
• 1.3.毛细管电泳简介
• 1.3.1.毛细管电泳的基本原理
• 1.3.2.毛细管电泳仪的基本结构
• 1.3.3.毛细管电泳分析的分离模式
• 1.3.4.毛细管电泳的应用
• 1.3.5.毛细管电泳的发展方向
• 1.4.氨基酸分析进展
• 1.4.1.氨基酸的结构特点及测定方法
• 1.4.2.毛细管电泳法分析氨基酸
• 1.4.2.1.氨基酸非荧光衍生分析法
• 1.4.2.2.氨基酸荧光衍生分析法
• 1.5.毛细管电泳法分析糖类物质的现状
• 1.5.1.基本问题
• 1.5.2.电泳分离基本策略
• 1.5.2.1.络合法
• 1.5.2.2.强碱电离
• 1.5.3.检测方法
• 1.5.3.1.直接检测
• 1.5.3.2.间接检测
• 1.5.3.3.糖的衍生检测
• 1.6.本课题的目的和意义
• 第二章 氨基酸含量的毛细管电泳测定
• 2.1.仪器与试剂
• 2.2.实验方法
• 2.2.1.溶剂的配制
• 2.2.2.衍生条件的确立
• 2.2.3.氨基酸MEKC法的研究
• 2.2.4.Tris浓度与温度条件的研究
• 2.2.5.SOS浓度对分离的影响
• 2.2.6.电压的选择
• 2.2.7.氨基酸定性研究的方法
• 2.2.8.PITC衍生法测定氨基酸的方法验证
• 2.2.9.培养基和发酵液中游离氨基酸的检测
• 2.3.实验结果
• 2.3.1.氨基酸MEKC法结果
• 2.3.2.Tris浓度与温度条件的研究结果
• 2.3.3.SDG浓度实验结果
• 2.3.4.电压实验结果
• 2.3.5.氨基酸定性实验结果
• 2.3.6.PITC衍生法测定氨基酸的方法验证结果
• 2.3.7.培养基和发酵液中游离氨基酸检测实验结果
• 第三章 毛细管电泳分析单糖和寡糖的研究
• 3.1.实验仪器与试剂
• 3.2.磷酸缓冲液中糖类间接紫外检测初步研究
• 3.2.1.实验方法
• 3.2.1.1.溶液的配制
• 3.2.1.2.混合糖的电泳分析条件及其改进
• 3.2.2.实验结果
• 3.3.硼砂缓冲液中糖类间接紫外检测研究
• 3.3.1.实验方法
• 3.3.1.1.样品的配制
• 3.3.1.2.电泳条件
• 3.3.1.3.硼砂浓度考察实验
• 3.3.1.4.最适分离pH实验
• 3.3.1.5.吲哚-3-乙酸浓度实验
• 3.3.1.6.非还原糖定性研究方法
• 3.3.1.7.硼砂缓冲体系测定非还原糖方法验证
• 3.3.1.8.培养基和发酵液中非还原糖的检测
• 3.3.2.实验结果
• 3.3.2.1.硼砂浓度考察实验结果
• 3.3.2.2.最适分离pH实验结果
• 3.3.2.3.吲哚-3-乙酸浓度实验结果
• 3.3.2.4.非还原糖定性实验结果
• 3.3.2.5.硼砂缓冲体系测定非还原糖方法验证结果
• 3.3.2.6.培养基和发酵液中非还原糖测定结果
• 3.4.α-萘胺衍生法测定还原糖研究
• 3.4.1.实验方法
• 3.4.1.1.样品与试剂的配制
• 3.4.1.2.衍生方法和电泳条件
• 3.4.1.3.检测波长的选择
• 3.4.1.4.还原糖定性实验
• 3.4.1.5.α-萘胺衍生法测定还原糖方法验证
• 3.4.2.实验结果
• 3.4.2.1.检测波长选择实验结果
• 3.4.2.2.还原糖定性实验结果
• 3.4.2.3.α-萘胺衍生法测定还原糖方法验证结果
• 3.5.DHZ衍生法研究
• 3.5.1.实验方法
• 3.5.1.1.试剂的配制
• 3.5.1.2.样品的配制
• 3.5.1.3.分离条件
• 3.5.1.4.衍生时间选择实验
• 3.5.1.5.检测波长的选择
• 3.5.1.6.缓冲体系最佳pH考查
• 3.5.1.7.还原糖定性实验
• 3.5.1.8.DHZ衍生法测定还原糖方法验证
• 3.5.1.9.发酵液中还原糖的测定
• 3.5.2.实验结果
• 3.5.2.1.衍生时间选择实验实验结果
• 3.5.2.2.检测波长选择实验结果
• 3.5.2.3.缓冲体系最佳pH考查结果
• 3.5.2.4.还原糖定性实验结果
• 3.5.2.5.DHZ衍生法测定还原糖方法验证结果
• 3.5.2.6.发酵液中还原糖的测定结果
• 第四章 结论与讨论
• 4.1.结论
• 4.2.讨论
• 参考文献
• 致谢