激光拉曼光谱成像系统的研制及其应用

论文摘要

激光光镊拉曼光谱（Laser tweezers Raman spectroscopy, LTRS）技术是将激光光学囚禁技术和拉曼光谱技术相结合应用于悬浮细胞、生物大分子等进行研究的一种光子技术。更是一种无损、快速、灵敏的光谱学检测方法。由于水的拉曼散射非常微弱,所以该技术适合于对水溶液中生物大分子、细胞等进行研究。该技术应用光镊把细胞俘获或囚禁在玻片上方10微米左右的位置,所以可以消除其他拉曼光谱技术将细胞囚禁在溶液中和玻片上所引起的不良影响。并且光镊将细胞长时间囚禁在激光的焦点附近,在优化了散射光的收集光路的同时,还可以得到更高信噪比的光谱。虽然激光光镊拉曼光谱技术已经具有如此多的优势,但这种技术只是对直径较小的细胞有很好的针对性,对像肝癌细胞这样直径较大的细胞并不能全部获取其中的光谱信息。肝癌已经成为死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤,但初期症状并不明显。所以对肝癌的检测就成为了目前医学研究的重要课题。所以本文在激光光镊拉曼光谱技术的基础上进行改进,构建了激光拉曼光谱成像系统。拉曼光谱成像可以降低分子成像的成本,同时可以提供更高的图像敏感度,还有更强的空间分辨率,以及更完善的浏览多重信号的能力。拉曼光谱成像已经成为当前所有成像技术中较为优越的一种技术。本文应用这种重构的激光拉曼光谱成像系统对肝癌细胞进行了成像研究,获得了单个肝癌细胞微区的拉曼光谱图谱,同时计算出786 cm-1、1450 cm-1和1658 cm-1等特征峰的峰面积,这些特征峰分别归属于DNA、脂类和蛋白质,根据归一化后的数值在相应的细胞扫描位置给出不同颜色值成像,重构出这些物质的拉曼特征峰在肝癌细胞中的分布图。结果表明,应用这种方法可以很明确的看到DNA、脂类及蛋白质特征峰在细胞中的分布情况,并且通过荧光染色验证了成像系统的可靠性。因此,可以通过特征峰的成像图确定物质在细胞中的微区分布情况,为拉曼方法检测和诊断肝癌提供了可靠的依据和重要的参考价值。可见,拉曼成像可以成为一种大直径的单细胞分析的有利工具。红细胞是人体血液的重要组成部分,是血液中数量最多的一种血细胞。同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介,并且还具有免疫功能。研究红细胞的结构和功能有助于深入了解红细胞的携氧能力,甚至血液疾病的病理,为诊断和治疗红细胞相关疾病提供理论依据。激光光镊拉曼光谱技术对红细胞的研究已经表现出了独特的优势,但在活体中对红细胞的研究并不多见,本文应用激光光镊拉曼光谱技术对活体小鼠耳朵血管中血红细胞进行研究,得出了以往在体外红细胞研究中并未得出的一些重要结论。主要结论如下：主要应用拉曼光谱与光镊技术对活体小鼠动脉毛细血管和静脉毛细血管中的全血以及毛细血管中的单个红细胞和体外的全血和单个红细胞进行研究。光谱分析显示,1.我们可以获得活体血液的拉曼光谱；2.在动脉毛细血管和静脉毛细血管中可以观察到清晰的携氧与去氧血液的不同光谱；3.单个血红细胞的光谱分析表明：在体内血管中血红细胞的血红蛋白浓度比体外的更高,在动脉毛细管中的血红细胞的携氧态特征峰明显,且具有统计学差异；4.通过比较动脉、静脉毛细血管中红细胞的拉曼光谱表明,动脉毛细血管中的pH值比静脉毛细血管中的pH值更高。通过对1604 cm-1特征峰在活体毛细血管中携氧态和去氧态红细胞光谱差异的研究发现,1604 cm-1特征峰的变化与红细胞所处的环境的pH值有关,当环境pH变大,1604 cm-1特征峰的强度会变小,而当环境的pH变小时,1604 cm-1特征峰的强度则变大。以上结果表明,在活体中研究血液及单个红细胞的信息变化是可以实现的,同时表明拉曼光谱与光镊技术是一种进行活体中单个细胞研究的强而有力的工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 绪论
• 一 光镊的原理
• （一） 光镊的定义
• （二） 光压
• （三） 散射力与梯度力
• 二 激光光镊拉曼光谱技术
• （一） 拉曼散射的解释
• （二） 拉曼光谱的特点
• （三） 激光光镊拉曼光谱技术
• 三 小结
• 第2章 拉曼成像技术
• 一 前言
• 二 拉曼成像显示化学成分和结构
• 三 基本概念
• 四 成像方法
• （一） 点到点扫描成像
• （二） 线扫描成像
• （三） 超宽视野扫描成像
• 五 拉曼成像拟解决的问题
• 六 拉曼光谱图像处理方法
• （一） 因子分析法
• （二） 聚类分析法
• 七 拉曼成像的应用
• （一） 拉曼成像在生物医学上的应用
• （二） 拉曼成像在研究药物片剂中活性组分分布
• 八 小结
• 第3章 单个肝癌细胞的拉曼成像研究
• 一 引言
• 二 实验材料和方法
• （一） 样品来源与处理方法
• （二） 实验装置与光谱收集
• （三） 拉曼逐点扫描的实现过程及数据处理
• 三 实验结果与分析
• （一） 峰面积成像与谱特征
• （二） DNA特征谱成像与荧光成像比较
• 四 小结
• 第4章 活体小鼠中单个红细胞的拉曼光谱分析
• 一 引言
• 二 实验部分
• （一） 实验装置
• （二） 样品准备
• （三） 数据处理
• 三 结果与讨论
• （一） 活体与体外全血拉曼光谱比较
• （二） 活体和体外单个血红细胞拉曼光谱
• 四 小结
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 硕士研究生期间所发表的论文
• 致谢