多巴胺合成相关基因的表达与其空间距离关系的研究

论文摘要

随着染色体构象捕获及其衍生技术的发明与发展，表观遗传学不再局限于平面的研究，基因的远距离相互作用和细胞核的三维空间构象成为研究的热点。染色体地域间的交叉导致基因的远距离相互作用，而这种相互作用使基因的空间构象发生动态变化。相互作用的基因间是否存在功能上的联系？基因空间构象的动态变化与基因的表达有没有直接关系？这些疑问成为此领域亟待解决的问题。本文以上述疑问为研究目的，以多巴胺合成通路基因为研究对象，以Nuero-2A和PC12细胞系为研究材料，采用Q-PCR检测诱导前后基因表达的变化，再用3D-DNA-FISH研究处理前后基因的空间构象的变化。最终，在Nuero-2A细胞系中发现，功能相关的基因在空间上有相互靠近的趋势，而这种趋势似乎与基因表达没有直接的联系。另外，实验验证了ETV1对多巴胺合成相关基因的调控具有种属特异性，发现了Th基因的表达受到PKA和PKC的共同作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 细胞核空间结构研究进展
• 1.1.1 染色体构象捕获及其衍生技术
• 1.1.2 亚细胞核结构的研究
• 1.1.3 不同基因共享转录工厂的研究
• 1.2 荧光原位杂交原理与概述
• 1.2.1 原位杂交
• 1.2.2 荧光原位杂交
• 1.2.3 TSA 信号放大系统的工作原理
• 1.3 多巴胺相关知识的概述
• 1.3.1 多巴胺的生理作用
• 1.3.2 多巴胺的合成通路
• 1.3.3 多巴胺合成的相关基因
• 1.4 Th 和 Dbh 基因表达的调节途径
• 1.5 研究的内容和意义
• 第二章 实验的可行性验证
• 2.1 实验材料和器材
• 2.1.1 细胞制备材料
• 2.1.2 DNA-FISH 材料
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞的培养
• 2.2.2 细胞分裂中期同步化
• 2.2.3 3D-DNA-FISH
• 2.2.3.1 BAC DNA 的分离和纯化
• 2.2.3.2 探针的制备
• 2.2.3.3 细胞的准备
• 2.2.3.4 DNA FISH 杂交
• 2.2.4 2D-DNA-FISH
• 2.3 探针的特异性验证
• 2.3.1 细胞分裂中期同步化
• 2.3.2 探针与棒状染色体的杂交
• 2.4 DNA-FISH 检测基因共定位
• 2.5 三色 DNA-FISH
• 2.6 实验讨论与小结
• 第三章 小鼠 Neuro-2A 细胞中基因表达与空间距离的关系
• 3.1 实验材料与器材
• 3.1.1 基因表达相关试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 TRIZOL 法提取 RNA、反转录以及 Q-PCR 的步骤
• 3.3 基因表达的变化
• 3.3.1 Neuro-2A 细胞中多巴胺合成相关基因的表达
• 3.3.2 基因表达的诱导
• 3.4 基因空间距离的变化
• 3.4.1 肿瘤细胞 FISH 背景较高
• 3.4.2 Th 与 Gch1 在空间上相互靠近
• 3.4.3 基因表达的变化与空间距离的关系
• 3.5 实验讨论与小结
• 第四章 大鼠 PC12 细胞中基因表达与空间距离的关系
• 4.1 实验材料与器材
• 4.1.1 引物的合成与测序
• 4.1.2 菌株、细胞株和质粒
• 4.1.3 细胞培养与转染
• 4.1.4 分子生物学相关耗材
• 4.1.5 免疫荧光及 FISH 相关耗材
• 4.1.6 细菌培养相关耗材
• 4.1.7 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 免疫荧光
• 4.2.2 载体的构建
• 4.2.3 真核细胞转染
• 4.2.4 生物素标记探针与 TSA 信号放大系统
• 4.3 PC12 细胞系的基因表达
• 4.3.1 PC12 细胞系中多巴胺合成相关基因的表达
• 4.3.2 酪氨酸羟化酶在 PC12 细胞系中的分布
• 4.4 Etv1 的过表达与敲低
• 4.4.1 真核过表达载体 pcDNA3.1-Etv1 成功构建
• 4.4.2 PC12 细胞中 Etv1 的过表达及对通路基因表达的影响
• 4.4.3 PC12 细胞中 Etv1 的敲低及对通路基因表达的影响
• 4.5 腺苷酸环化酶的激活和抑制对通路基因表达的影响
• 4.5.1 PC12 细胞系 FSK 可诱导相关基因表达变化
• 4.5.2 PC12 细胞系 MDL12,330A 处理条件的探索
• 4.5.3 激活和抑制腺苷酸环化酶对通路基因表达的影响
• 4.6 大鼠 Th 和 Dbh 探针的制备
• 4.7 实验讨论与小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢