鹦鹉热衣原体检测技术研究及重庆鹦鹉热衣原体流行病学调查

论文摘要

鹦鹉热衣原体（Chlamyida psittaci）引起的人畜共患病日趋严重,但其诊断尚缺乏准确快速的检测手段。因此迫切需要建立准确、快速的鹦鹉热衣原体PCR和RT-QPCR检测方法。为此,我们利用PCR和RT-QPCR建立了准确、快速的检测方法,研制出鹦鹉热衣原体PCR检测试剂盒;利用建立的定量PCR检测初步探索了鹦鹉热衣原体感染同检测间的量化关系;并利用建立的PCR方法同IHA方法对比进行流行病学调查。本研究主要获得以下研究结果:①鹦鹉热衣原体PCR检测方法的建立。利用NCBI上公布的鸟源主要外膜蛋白MOMP基因序列（PSITTACI 457203）设计引物,利用鸭源CS1 DNA为模板,通过优化反应体系,得到100 bp的目标检测片段,建立了鹦鹉热衣原体的PCR检测方法,灵敏度可以达到2.5×10-5 ng/μl模板量,构建了鹦鹉热衣原体PCR检测试剂盒。②鹦鹉热衣原体Real-time quantitative PCR检测方法的建立。将PCR扩增得到的目标片段作为Real-time quantitative PCR的模板和阳性对照,利用两种定量PCR仪分别建立了鹦鹉热衣原体定量PCR反应体系。所建立的Real-time quantitative PCR检测方法,在模板浓度范围1.78×102-1.78×108拷贝/μl时,其线性相关系数达到0.998;融解曲线只有唯一的峰值,Tm值为79.1℃;批内和批间变异系数（CV%）分别为1.30-4.59%和5.72-9.87%。③利用建立的鹦鹉热衣原体Real-time quantitative PCR检测方法进行小白鼠感染的量化分析试验。通过对随机分成的7组,每组12只的小白鼠,一组为对照组,其他各组同时腹腔注射Cps菌液,每天进行1次抽样检测,监控小白鼠感染后的体内Cps量的变化关系,初步探索了动物CPS感染和Real-time quantitative PCR检测的量化关系。④对重庆市6个区县不同养殖环境下的禽类随机采集血清样品400份和相对应的组织样品430份,利用IHA诊断试剂盒初步检测筛选出可疑样品,然后利用本研究构建的鹦鹉热衣原体PCR反应体系对可疑样品进行进一步检测。对IHA检测出的157分阳性血清所对应的157份组织样品进行PCR检测,共检出146份样品呈阳性,检出样品的阳性率为93.0%,结果表明所建立的鹦鹉热衣原体PCR检测方法的特异性和稳定性均较好。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 鹦鹉热衣原体感染现状
• 1.1.2 鹦鹉热衣原体检测技术研究进展
• 1.2 研究目的
• 1.3 研究内容和技术路线
• 2 鹦鹉热衣原体PCR 检测技术的研究及其试剂盒的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 供试菌种
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.2.3 主要试剂及培养基
• 2.2.4 鹦鹉热衣原体在Hela 细胞中的培养
• 2.2.5 鹦鹉热衣原体DNA 提取
• 2.2.6 特异性基因的选择及引物设计
• 2.2.7 PCR 体系的建立
• 2.2.8 PCR 灵敏度测定
• 2.2.9 PCR 产物电泳检测
• 2.2.10 PCR 产物回收及测序
• 2.3 PCR 检测试剂盒的构建
• 2.3.1 PCR 检测试剂盒的构建
• 2.3.2 鹦鹉热衣原体PCR 检测试剂盒性能的验证
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 鹦鹉热衣原体在Hela 细胞中的培养
• 2.4.2 鹦鹉热衣原体目标片段扩增
• 2.4.3 鉴定重组质粒
• 2.4.4 PCR 灵敏度测定
• 2.4.5 鹦鹉热衣原体PCR 检测试剂盒储存稳定性验证
• 2.5 讨论与小结
• 3 鹦鹉热衣原体定量PCR 检测技术的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 供试菌种（见2.2.1）
• 3.2.2 主要仪器设备（见2.2.2）
• 3.2.3 主要试剂（见2.2.2）
• 3.2.4 材料处理及总DNA 的提取
• 3.2.5 DNA 标准品的制备
• 3.2.6 基因选择及引物设计
• 3.2.7 SYBR GreenⅠ荧光染料法定量PCR 反应体系及反应条件
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 标准品的制备
• 3.3.2 标准曲线的建立
• 3.3.3 融解曲线
• 3.3.4 可重复性
• 3.4 讨论与小结
• 4 重庆地区鹦鹉热流行病学调查
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器设备（同2.2.2）
• 4.2.2 主要试剂（见2.2.3）
• 4.2.3 方法
• 4.2.4 血清学检测方法
• 4.2.5 PCR 检测方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 重庆鹦鹉热衣原体流行病学调查
• 4.3.2 重庆市5 种禽类Cps 的感染状况
• 4.4 讨论与小结
• 5 定量PCR 检测与鹦鹉热衣原体感染的量化关系探索
• 5.1 引言
• 5.2 材料和设备
• 5.3 方法
• 5.3.1 小白鼠感染的预试验
• 5.3.2 小白鼠鹦鹉热衣原体感染和定量PCR 检测量化关系试验
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 定量PCR 检测与鹦鹉热衣原体感染的量化关系预试验结果
• 5.4.2 定量PCR 检测与鹦鹉热衣原体感染的量化关系试验结果
• 5.5 讨论与小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录