论文摘要
实验背景和目的:关节软骨破坏的重要病理表现是软骨细胞外基质（ECM）的减少,其中,聚蛋白多糖丢失是关节炎的主要病理表现之一。聚蛋白多糖可以被基质金属蛋白酶（MMP）和聚蛋白多糖酶（Aggrecanase）分别在核心蛋白球间区（IGD）的Asn341-Phe342位点和Glu373-Ala374位点降解,并分别产生FFGxx和ARGxx的新肽链。迄今为止被广泛认可的聚蛋白多糖酶有ADAMTS-4和ADAMTS-5,在MMP家族中MMP-2有广泛的作用底物,包括聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原,MMP-3则是MMP家族中降解聚蛋白多糖最强者。尽管聚蛋白多糖酶和MMP都能裂解聚蛋白多糖的核心蛋白,而在疾病状态下哪种酶起主要作用以及聚蛋白多糖酶的上调因素仍然是近年来争论的热点问题。有体外软骨培养体系证实最初几周降解聚蛋白多糖的酶是聚蛋白多糖酶,MMP在几周后才发挥作用,聚蛋白多糖酶在软骨降解的后期的作用尚不清楚,而且影响软骨细胞表达聚蛋白多糖酶的因素更加复杂,甚至在体外试验中的研究结果也有很大差异,比如有报道用IL-1处理培养的正常人软骨,不影响ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达,而另有报道人软骨细胞经IL-1刺激后,增加了ADAMTS-4的表达,却不影响ADAMTS-5的表达。骨关节炎（OA）和类风湿性关节炎（RA）都有关节软骨破坏的病理表现,但是二者的疾病性质却不相同。OA是非炎性的退行性关节炎,RA则是自身免疫性疾病,是炎性关节炎,炎症因子,如IL-1,在其中起了重要作用。对两种疾病的比较研究不仅可以比较聚蛋白多糖酶和MMP的作用,还对揭示人类疾病状态下聚蛋白多糖酶的表达调节有重要意义。本文通过对ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-2和MMP-3以及它们的产物在OA和RA病变关节的软骨、滑膜和关节液中的表达比较,探讨了聚蛋白多糖酶和MMP在人类疾病状态下的不同作用以及可能的激活机制。材料和方法:本研究所有标本均取自人类膝关节股骨髁,共有OA软骨和滑膜21例;OA关节液32例;RA软骨9例、滑膜12例、关节液28例;正常软骨3例。15例OA软骨的进行了组织块培养（5天）,并在第一天应用10ug/ml的IL-1β对培养的软骨块进行了刺激。应用免疫组织化学方法观察了3例正常软骨、15例OA培养前后的软骨的ADAMTS-4的表达,比较了ADAMTS-4在不同软骨的表层、中层和深层分布;应用半定量RT-PCR方法检测了ADAMTS-4mRNA在3例正常软骨和15例OA培养前后的软骨中的表达差异。还应用免疫组织化学方法观察了ADAMTS-4和ADAMTS-5在21例OA软骨和滑膜、9例RA软骨、12例RA滑膜中的表达比例和分布区域,并进行了比较;应用酶联免疫吸附实验（ELISA）观察了ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-2和MMP-3以及ARGxx和FFGxx在32例OA关节液和28例RA关节液中的表达,以ELISA吸光度（OD）值代表所测各项在关节液中的浓度,对结果进行t检验和相关性分析。结果:在3例正常软骨的免疫组化切片中,只有极少数软骨细胞中有ADAMTS-4表达;OA软骨的ADAMTS-4表达区域主要分布在软骨表层的细胞内,中层细胞表达较少,深层软骨细胞则几乎没有表达;当OA软骨表层磨损后,ADAMTS-4阳性细胞主要分布在中层靠近关节表面的区域,靠近深层的区域很少有阳性细胞,深层的软骨细胞仍然几乎没有ADAMTS-4的表达;当软骨进一步磨损,中层也消失后,深层细胞可见增生并表达ADAMTS;当OA软骨在经过与IL-1β共同培养后,ADAMTS-4表达量增加;统计结果显示培养前后的OA软骨的表层和中层ADAMTS-4阳性细胞数均显著高于正常软骨;OA软骨培养前后相比较可见表层阳性细胞数没有差异,而培养后的OA软骨中层阳性细胞数明显增多。RT-PCR的结果显示ADAMTS-4 mRNA的表达在OA软骨中明显高于正常软骨,IL-1刺激后的软骨明显高于OA软骨。所有OA和RA软骨中均有ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达,但表达部位不同,ADAMTS-4、5在OA软骨中主要表达在表层,RA软骨的表层已被血管翳替代,其细胞强烈表达聚蛋白多糖酶,而且软骨中层出现阳性细胞的例数明显高于OA;OA滑膜出现ADAMTS-4和ADAMTS-5阳性细胞的比例分别为52%（11/21）和43%（9/21）与RA的50%（6/12）和58%（7/12）相比较没有显著差异。ELISA结果显示ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-2和MMP-3以及ARGxx和FFGxx在RA关节液中的浓度均高于OA关节液,结果有显著差异（p＜0.01）。RA和OA关节液中ARGxx的浓度明显高于FFGxx（p＜0.01）;ADAM7S-4的浓度均高于ADAMTS-5（p＜0.01）;MMP-3的浓度均高于MMP-2（p＜0.01）。OA关节液中ADAMTS-4的浓度与ARGxx成正相关（r=0.38,p＜0.05）;ADAMTS-5与ARGxx以及MMP-2、MMP-3与FFGxx均无明显相关关系。RA关节液中所测各酶与其产物之间均无相关关系。结论:（1）ADAMTS-4在严重磨损的软骨中大量表达,说明它不仅在OA早期起着重要作用,在中晚期OA的软骨降解中仍然有重要作用;抑制ADAMTS-4对治疗中晚期OA仍然有意义;（2）聚蛋白多糖酶总是集中表达在软骨的靠近关节面的区域,强烈支持OA发病机制的机械应力学说,并且说明机械应力并非简单地引起的磨损,同时可能是摩擦力激活了聚蛋白多糖酶,两者的共同作用导致了软骨的逐渐变薄;（3）关节液中ARGxx多于FFGxx提示对OA和RA关节软骨聚蛋白多糖的丢失,聚蛋白多糖酶比MMP起了更大的作用;（4）OA病变关节中软骨细胞是聚蛋白多糖酶的主要来源,在RA病变关节中聚蛋白多糖酶主要来源于软骨细胞和血管翳;OA和RA的滑膜均少量表达聚蛋白多糖酶;（5）IL-1β可以上调ADAMTS-4的基因表达,与机械摩擦力相比两者作用的部位是不同的,提示OA出现滑膜炎症时可以加速软骨的降解;（6）RA关节液中聚蛋白多糖酶和MMP以及其代谢产物均高于OA关节液,提示在人类关节炎疾病过程中炎症因子不仅参与上调MMP,同时上调了聚蛋白多糖酶的表达。