新型超微载体FA-PAMAM介导hTERT siRNA对人脑胶质瘤细胞U251抑制作用的体外研究

论文摘要

胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤,易复发,难根治。其中恶性胶质瘤约占60%,传统的手术、放疗及化疗等治疗效果欠佳,目前尚无根治的方法。因此明确其发生发展机理,探索有效的治疗方法已成为当今神经外科亟待解决的问题。随着分子生物学的发展,人们逐渐认识到肿瘤发生的机制主要是由于癌基因的激活和抑癌基因的失活而导致的肿瘤细胞增殖失控、凋亡缺陷以及细胞正常的有限生命周期缺陷,使细胞永生化,继而形成肿瘤。目前国内外研究发现细胞的永生化主要由于在某些因素的作用下激活了细胞内部的端粒酶,进而通过端粒酶来增加端粒序列,稳定端粒长度,从而提高细胞增殖能力并使其永生化。因此,端粒酶的激活可以说是细胞永生化的关键步骤。端粒是指真核细胞线状染色体末端的一段区域,由许多有种属特异性的简单重复的DNA序列及与其特异性结合的蛋白质构成,它给染色体末端提供一个保护性“帽”。在人和其它脊椎动物中重复序列为5’-TTAGGG-3’。1984年Greider和Blackburn在美国柏克莱的Blackburn的实验室首次从四膜虫细胞提取液中发现有端粒酶的活性。1989年Morin首次在人的癌细胞系Hela细胞中发现了端粒酶。端粒酶是一种核糖核蛋白体（ribonucleoprotein、RNP）,由RNA与蛋白质构成的复合体,是一种特殊的反转录RNA依赖性DNA聚合酶,能以自身的RNA为模板,通过逆转录而合成端粒,将端粒重复片段加到染色体的末端。因此它解决了DNA半保留复制模式中末端复制问题。Counter等1994年首先在转移性卵巢癌病人中检测到端粒酶活性。近几年来各国学者报道了大量有关肿瘤和端粒酶之间关系的文献,结果发现人正常体细胞中除生殖细胞和大多数发育中胚胎细胞及有增殖能力的更新组织中有较高的端粒酶活性外,大多数端粒酶阴性,通过对5000例以上的肿瘤标本进行端粒酶活性的检测发现,其中约85%为阳性,90%以上的恶性肿瘤中端粒酶阳性,且端粒酶的活性随着肿瘤恶性程度的增高而增高。人端粒酶包括自身RNA（human telomerase RNA,hTR）、催化亚基（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）和相关蛋白1（telomerase associated protein 1,TP1）。hTERT属于逆转录酶（reversetranscriptase,RT）家属成员,是一个有约40kb大小的单拷贝基因,定位于5p15.33。催化亚基基因首先是Lendvay在酵母中发现。1997年编码hTERT的基因被克隆出来。hTERT启动子序列于1999年被克隆出,有1.7Kb长,其中有251bp（-211～+40）是核心部分。近年来的研究发现hTERT mRNA除在胸腺、睾丸、小肠等几种正常组织中有低水平表达外,在大多数正常组织（心、脑、乳腺、肝、骨骼肌、前列腺、胎盘、卵巢）中都没有检测到。但对各种肿瘤组织的检测发现,hTERTmRNA在大多数肿瘤组织中表达,在所有的端粒酶阳性的肿瘤组织中都可检测到hTERT mRNA。在对脑肿瘤中hTERT mRNA的研究中发现:hTERT mRNA在胶质瘤细胞中存在高表达,hTERT mRNA和hTERT蛋白表达水平与胶质瘤的恶性程度密切相关,且随着肿瘤的恶性度增加而升高,而正常脑组织中则没有hTERT的表达。目前认为hTERT是端粒酶的催化蛋白组分,同时也是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤,抑制其表达可有效地抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡,可作为胶质瘤基因治疗的理想靶标。当前针对胶质瘤的基因治疗方案主要包括免疫增强治疗、基因介导的酶前体药物治疗,抑癌基因替代治疗和反义治疗等。这些方法主要是通过将外源性目的基因导入宿主靶细胞内,使之表达以纠正细胞基因缺陷,达到疾病治疗目的。随着分子生物学技术的发展,基因治疗的技术不断得到优化和改进。近年来研究发现,一些小的双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达,促使其mRNA降解,诱使细胞出现特定基因缺失的表型,这种技术即RNA干扰（RNA interference,RNAi）,属于转录后基因沉默（post-transcrptionalgene silencing,PTGS）。RNAi现象广泛存在于大多数真核细胞中,在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也可以成功阻断基因的表达,实现细胞水平的基因敲除。基因治疗成功与否的关键在于采用理想的载体将靶基因高效地转导入靶细胞并获得良好的表达,这就对基因治疗的载体提出了较高的要求。目前常用的载体分为病毒载体和非病毒载体两大类,前者虽具有较高的转染效率,但安全性较差,因此近年来人们更专注于非病毒载体的开发和应用。聚酰胺-胺型高聚物（polyamidoaminedendrimer,PAMAM）是一种具有较高转染效率和低细胞毒性的非病毒载体。经叶酸（folic acid,FA）修饰后的PAMAM（FA-PAMAM）还可具有胶质瘤细胞靶向性的特征。基于以上几点,本试验首先制备超微载体FA-PAMAM,使其结合hTERT-siRNA,在体外转染人脑胶质瘤细胞U251细胞,通过RNAi的机制抑制胶质瘤细胞高表达的hTERT,探讨其对胶质瘤细胞生长的抑制作用。第一部分新型超微载体FA-PAMAM的制备及转染效率的测定由于人脑胶质瘤的常规治疗方法效果不佳,探求新的治疗策略已成当务之急。胶质瘤的基因治疗近年来发展迅速,并取得一定进展。但由于基因治疗本身的一些制约条件,比如载体的安全性及转染效率较低等,使得基因治疗的发展受到一定的限制。因此,探讨应用一些高转染效率,低细胞毒性的新型靶向载体来介导基因产物进行治疗已成为胶质瘤基因治疗研究的新热点。选择合适的基因转运载体将目的基因安全高效地导入细胞,是基因治疗成功的关键。从目前发展趋势来看,阳离子聚合物载体在基因转运方面呈现显著优势,其中PAMAM以其优越的理化性能和较理想的基因转运能力而日益受到重视。研究证明,PAMAM可以高效介导基因或药物转染多种肿瘤细胞株和原代培养细胞,并且具有缓释、安全无毒等优点。叶酸受体（folate receptor,FR）是一种在肿瘤细胞膜表面高表达的细胞因子,在包括胶质瘤在内的恶性肿瘤细胞膜表面其活性和数量显著高于正常细胞,而且叶酸为小分子物质,与PAMAM共价结合后不会影响PAMAM的形态特征,所以经叶酸修饰过的PAMAM就具有了胶质瘤细胞靶向性的特征。本研究利用FAM荧光标记的hTERT-siRNA作为治疗基因,选择FA-PAMAM作为基因转运载体,在体外转染人脑胶质瘤细胞U251,利用流式细胞仪分析转染效率,并以空载体为对照,对超微载体FA-PAMAM的细胞毒性进行了连续观察和分析。此部分研究旨在探索利用FA-PAMAM超微载体转基因治疗胶质瘤的可行性,进一步为胶质瘤基因治疗寻求一种较理想的基因转运手段。研究结果表明:通过流式细胞仪检测新型超微载体FA-PAMAM对人脑胶质瘤细胞U251的转染效率,得到FA-PAMAM的转染效率为67.36%,此效率比文献报道的商业化的oligofectamine高出近一倍左右,完全可用于胶质瘤基因治疗的体外试验。此外,空载体组细胞生长状态良好,细胞凋亡率与不加任何干预的空白对照组相近,这就证明了FA-PAMAM是一种低细胞毒性的载体,可以用于胶质瘤基因治疗的研究。第二部分FA-PAMAM介导hTERT siRNA体外抑瘤作用的研究hTERT是端粒酶催化亚基,常常只在增殖的细胞中表达,是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤,抑制其表达可有效地抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡,已成为目前肿瘤基因治疗的理想靶标。RNAi通过双链RNA产生序列特异性的转录后基因沉默,在哺乳动物细胞内可高效特异地阻断特定基因的表达。它是将导入生物体内的或内源性转录生成的dsRNA被一种RNaseⅢ类的核酸酶Dicer切割成21～25nt的干扰性小RNA,即siRNA,siRNA进一步与其他多种蛋白成分结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）,最后由RISC介导siRNA反义链与靶mRNA分子互补结合并引起同源性靶mRNA分子的切割效应。我们在第一部分中已经成功制备了具有高转染效率和胶质瘤细胞靶向特性的基因治疗载体FA-PAMAM,在这一部分,我们设计了针对hTERT的siRNA,对人胶质瘤细胞系U251细胞进行基因干扰治疗的研究,结果分别用MTT法、RT-PCR、TRAP法和Transwell法分析转染后细胞增殖率、hTERT mRNA的表达,端粒酶的活性以及细胞侵袭能力,探讨其对胶质瘤细胞生长的抑制作用及其机制。结果显示:hTERT-siRNA在体外可明显抑制U251细胞系的生长,在给予一次剂量情况下,转染48小时后hTERT-siRNA抑制作用最强,干涉组细胞活力仅为68.97%（F=234.35,P＜0.05）,空载对照组为99.88%。hTERT-siRNA转染U251细胞后,hTERT mRNA的表达明显减少,端粒酶活性水平显著下降;空白组和空载组转染后hTERT mRNA及端粒酶活性无明显改变。转染后细胞的侵袭能力明显下降,空白组和空载组转染后细胞侵袭能力无明显改变。由上述结果可以看出:hTERT-siRNA能抑制肿瘤细胞hTERT mRNA的表达,使肿瘤细胞的端粒酶活性水平下降,从而抑制肿瘤细胞生长、增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,并且降低其侵袭能力。综合以上两部分的实验结果,我们认为,hTERT是胶质瘤基因治疗的理想靶点,RNAi和FA-PAMAM基因转运技术有机结合治疗胶质瘤是一种切实可行的新策略,可望为日后胶质瘤的基因治疗开辟一个全新的技术平台,具有广阔的应用前景。但与此同时,许多重要的问题包括hTERT表达调控网络及其表达沉默诱导细胞凋亡机理等仍有待更深入的研究。

论文目录

中文摘要

英文摘要

第一部分

前言

1 材料与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二部分

前言