稀土元素引起小鼠肝脏损伤的分子机制

论文摘要

稀土元素是位于化学元素周期表IIIB族中的钪、钇及15种镧系元素的总称,由于具有独特的理化性质而在农业、工业、文化、医药及日常生活诸多领域广泛应用,从而导致越来越多的稀土化合物不可避免地通过食物链进入生态环境和人体。作为生物体非必须元素,势必对人类健康形成威胁。人们就其毒理学效应已开展了广泛的研究,但有关稀土元素引起肝脏损伤的作用机制研究得还不够深入,且多集中于单一稀土元素或稀土混合物。鉴于此,我们比较研究了镧、铈、钕三种稀土元素对ICR小鼠肝脏损伤的分子机制并探讨了稀土元素的4f电子层结构和变价特性与肝脏损伤的关系,旨在为稀土的生物安全应用提供参考。论文主要涉及以下内容:（1）研究了连续14天腹腔注射氯化稀土溶液（20mg/kg BW）对小鼠肝脏的毒性效应及其分子机制。腹腔注射14天后,发现小鼠体重并未发生明显变化,但肝体比显著增加,三种稀土元素在肝脏中均有明显的蓄积,其顺序为Ce3+>Nd3+>La3+>对照。通过光镜观察到La3+处理后引起肝组织嗜碱粒细胞增加和中央静脉淤血,Ce3+处理引起肝细胞坏死和嗜碱粒细胞大量增加,Nd3+处理组呈现肝脏组织中央静脉淤血和明显的血管扩张;血生化分析表明稀土处理后谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶、假胆碱酯酶活性显著上升,白蛋白/球蛋白比值下降,其顺序为Ce3+>Nd3+>La3+>对照,提示小鼠肝脏功能的损伤以Ce3+处理最严重,其次为Nd3+处理,La3+处理最轻。肝组织抗氧化结果显示:三种稀土元素均导致肝脏组织活性氧自由基大量积累,脂质过氧化加剧,而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化系统酶活性明显下降,非酶抗氧化剂还原型抗坏血酸和还原型谷胱甘肽含量也显著降低,表明稀土元素削弱了小鼠肝脏的抗氧化防御能力,对肝脏造成了氧化性伤害,其氧化性伤害程度为Ce3+>Nd3+>La3+。通过实时定量RT–PCR和ELISA分析表明,三种稀土元素处理后均引起了肝脏核转录因子–κB、巨噬细胞移动抑制因子、肿瘤坏死因子–α、白细胞介素–6、白细胞介素–1β、C反应蛋白、白细胞介素–4和白细胞介素–10等炎性细胞因子的基因及蛋白表达水平显著上升,其上升的幅度也表现为Ce3+>Nd3+>La3+>对照。这些结果提示稀土元素处理引起的肝脏病变与自由基的大量积累及炎性细胞因子的表达增加有密切关系,且也可能与稀土元素的4f电子层结构和变价特性有一定的关系。（2）深入研究了不同剂量CeCl3溶液连续灌胃45天后引起小鼠肝脏炎症反应的信号途径。结果表明随着灌胃剂量的升高,小鼠的生长逐渐减缓,肝体比增加,Ce元素在肝脏明显积累,在光镜下观察到肝细胞结构大面积模糊、间质管充血、水样变性、炎性细胞浸润及细胞核空淡化,肝功能分析显示血清谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶、假胆碱酯酶和亮氨酸氨肽酶活力也随之上升,而免疫球蛋白IgM含量明显下降。这表明高剂量CeCl3影响了肝脏的正常功能,并降低了机体免疫力。实时定量RT–PCR和ELISA分析表明CeCl3诱导了肝脏Toll样受体2、4（TLR2、TLR4）、核转录因子–κB（NF–κB）、NF–κBP52、NF–κBP65、NF–κB诱导激酶（NIK）、IκB激酶–α（IKK–α）、IκB激酶–β（IKK–β）和肿瘤坏死因子–α（TNF–α）的表达,而NF–κB抑制蛋白（IκB）和白细胞介素2（IL–2）的表达受到抑制,由此进一步证实CeCl3引起的小鼠肝脏炎症反应与炎性细胞因子表达的改变紧密相关。我们推测TLRs表达量的增加诱导NIK的活化,从而引起IKKs和IκB的磷酸化,IκB的蛋白泛素化和降解最终导致NF–κB的激活和随后的炎症。其可能的信号通路为CeCl3→TNF–α↑→TLRs （TLR2、TLR4）↑→NIK↑→IKKs（IKK–α、IKK–β）↑→IκB↓→NF–κB（NF–κBP52、NF–κBP65）↑→促炎细胞因子↑→炎症发生→肝损伤。（3）从体内、体外两方面比较研究了La3+、Ce3+和Nd3+对乳酸脱氢酶（LDH）及Ce3+对谷丙转氨酶（ALT）活性和构象的影响。发现在一定浓度范围内,三种稀土离子在体内和体外均可激活LDH,且低浓度时LDH活性逐渐增加,高浓度时其活性逐渐下降,其中Ce3+的激活作用最显著,其次为Nd3+;酶动力学分析表明LDH与三种稀土离子的亲和力强度为Ce3+>Nd3+>La3+;光谱学研究显示稀土离子与LDH的结合位点数Ce3+为1.2,La3+和Nd3+均为1.55;稀土离子处理导致LDH二级结构的改变,其中Ce3+处理后LDH结构变化最大,其次为Nd3+处理。推测稀土离子可通过改变酶的结构导致底物在酶活性中心的结合及酶催化活性发生变化。本研究再次证实稀土元素引起乳酸脱氢酶活性及构象的变化可能与稀土元素的4f电子层结构及变价特性有关。在一定浓度范围内,Ce3+在体内和体外也均可显著激活ALT;体外酶动力学分析表明Ce3+在低浓度范围内与ALT的亲和力较高。光谱学分析表明,Ce3+可以与ALT结合,结合位点为1.72,结合常数分别为4.82×108 L mol-1和9.05×107 L mol-1,且Ce3+的结合改变了ALT的二级结构,提示Ce3+引起ALT活性的变化与ALT构象的变化有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 研究背景
• 1 稀土元素对肝脏结构和代谢功能的影响
• 2 稀土元素对肝细胞的影响
• 3 稀土元素对肝脏抗氧化防御系统的影响
• 4 稀土元素对肝脏相关基因及蛋白表达的影响
• 5 稀土元素对肝脏相关生物大分子的影响
• 6 本论文立题假说
• 参考文献
• 第二章 腹腔注射镧、铈、钕对小鼠肝脏的毒性效应
• 1 实验部分
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 口服铈引起小鼠肝脏炎症反应的信号途径
• 1 实验部分
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 镧、铈、钕对乳酸脱氢酶和谷丙转氨酶结构-功能的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与讨论
• 3 小结
• 参考文献
• 结论与展望
• 攻读学位期间公开发表的论文
• 课题资助情况
• 致谢