论文摘要
研究背景与目的造血干细胞移植技术的不断发展,为许多恶性血液病、血液系统遗传性疾病、重型再生障碍性贫血及一部分实体瘤提供了治愈的机会,但其严重的并发症——移植物抗宿主病（GVHD）,特别是慢性移植物抗宿主病（cGVHD）是目前造血干细胞移植所面临的一大难题,慢性GVHD的发病机制尚不明确,累及范围和严重程度仍不可预示,目前尚无系统、有效的预防和治疗方案。因此阐明慢性GVHD的发病机理,寻找降低慢性GVHD、同时保留GVL效应、诱导免疫耐受的治疗方法,是目前亟待解决的关键问题。而建立标准化的慢性GVHD动物模型,为慢性GVHD的相关实验研究建立平台是解决这一问题的基础。T细胞活化和反应的双信号理论的建立和信号传递途径的分子基础与网络学说的揭示,为建立对被识别抗原的特异性移植免疫耐受,降低慢性GVHD的发生,保留GVL效应提供了新的靶点。Martin在一项临床实验中证实,去除移植物中的CD4+T细胞及部分CD8+T细胞,可降低GVHD的发生率,但同时白血病复发率增高,因此,单纯依靠去除移植物中T细胞的方法并不能延长造血干细胞移植患者的生存期,而阻断CD4-T细胞活化的双信号系统,诱导移植后免疫耐受将有可能降低慢性GVHD,同时保留GVL效应。故本研究:1.建立单倍体相合供者淋巴细胞输注诱导的小鼠慢性GVHD动物模型:2.利用所建立的模型评估阻断CD4+T细胞活化的双信号系统对慢性GVHD的作用;3.移植后100天各组小鼠体内接种小鼠红白血病细胞,估阻断CD4+T细胞活化的双信号系统对GVL效应的影响。4.单向混合淋巴细胞培养5天后检测各组小鼠的脾细胞刺激供者的T淋巴细胞增殖效应、对同种异体移植物的杀伤效应和对白血病细胞的杀伤效应。本研究旨在探讨TJU103和CTLA4-Ig阻断CD4+T细胞活化的双信号系统,对供者淋巴细胞输注诱导的慢性GVHD和GVL效应的影响,为临床预防和治疗慢性GVHD探索新的思路。方法:1.建立MHC单倍体相合供者淋巴细胞输注诱导的小鼠慢性GVHD动物模型。以近交系8—10周的雄性Balb/cH-2d、C57BL/6JH-2b小鼠为供者,以雌性6-8周CB6F1小鼠(Balb/c×C57BL/6J F1H-2d/b)为受者;输注等体积的RPMI1640的受者小鼠为阴性对照组,A、B、C实验组分别输注3×107、6×107、9×107个Balb/C小鼠脾细胞诱导MHC单倍体相合的小鼠慢性GVHD,D组输注6×107个C57BL/6JJ小鼠脾细胞诱导MHC单倍体相合的小鼠急性GVHD;PCR法动态观察小鼠Y基因的表达,进行嵌合体定性分析;定期观察小鼠的临床表现并评分,实验终点观察小鼠的病理变化并评分,根据病理结果,对各临床观察指标进行二分类Logistic回归危险度分析,寻找模型特征性的临床评价指标,并概括模型的特征。2.体内观察阻断CD4+T细胞活化的双信号系统对小鼠慢性GVHD的影响。在已建立的供者淋巴细胞输注诱导的小鼠慢性GVHD模型的基础上,以输注6×107个脾细胞诱导的慢性GVHD组为阳性对照,以基线条件相同输注等体积的RPMI1640组为空白对照,实验组A、B、C分别在输注前将供者细胞分别应用TJU103、CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig处理,输注后每3天分别给予TJU103、CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig腹腔注射。PCR法动态观察小鼠Y基因的表达,分析各种干预因素对嵌合体形成的影响;根据模型的评价标准观察小鼠的临床表现并评分,实验终点观察小鼠的病理变化并评分,评价干预因素对慢性GVHD的影响。3.体内观察阻断CD4+T细胞活化的双信号系统对GVL效应的影响。供者淋巴细胞输注后100天各组随机抽取一定数量的小鼠,腹腔注射同等数量的FBL-3细胞（小鼠红白血病细胞株,H-2b）,观察各组小鼠的生存时间;取频死小鼠断颈处死行病理检查,观察白血病细胞浸润情况,判定小鼠死亡的原因,评价各干预因素对移植物抗红白血病效应的影响。4.用单向混合淋巴细胞培养（MLC）方法体外动态监测各实验组小鼠脾细胞刺激宿主T淋巴细胞的增殖效应、对MHC单倍体相合移植物的杀伤效应和对红白血病细胞的杀伤效应的影响。供者淋巴细胞输注后35天、85天各组抽取一只小鼠,断颈处死取脾脏,制成单细胞悬液,用丝裂霉素C（MMC）处理后作为刺激细胞,以Balb/cH-2d小鼠脾细胞作为反应细胞,单向混合淋巴细胞培养5天,观察其增殖效应;以各组受者的脾细胞为靶细胞,观察单向混合淋巴细胞培养5天的反应细胞对其杀伤效应,评价其对MHC单倍体相合移植物的杀伤功能;以FBL-3细胞为靶细胞,单向混合淋巴细胞培养5天的反应细胞对其杀伤效应,评价其对红白血病细胞的杀伤功能。统计学方法:本实验数据应用SPSS13.0统计软件进行处理,以小鼠的病理损害,判定小鼠是否发病,对各临床观察指标进行二分类Logistic回归危险度分析;以Kaplan生存曲线描述各组小鼠的慢性GVHD的患病率并进行log-rank检验;以H检验比较各组小鼠GVHD的严重程度,Wilcoxon秩和检验进行组间比较;两独立样本非参数检验进行慢性GVHD的重复性检验;析因设计资料的方差分析比较各组35天和85天混合淋巴细胞反应的增殖率和反应细胞对靶细胞的杀伤率的差异;单因素方差分析比较各组小鼠负荷红白血病后的生存时间的差异,以LSD法行组间比较;以P≤0.05表示差异有统计学意义。结果1.MHC单倍体相合供者淋巴细胞输注诱导的小鼠慢性GVHD动物模型的建立。（1）嵌合体检测:输注6×107、9×107个Balb/c小鼠脾细胞组在2、5、8、12周均可检测出亮度较为均一的DNA条带,即形成了较为稳定的供受者混合嵌合体;输注3×107个Balb/c小鼠脾细胞组在2、5周可检测出亮度较弱的DNA条带,但8、12周未能检测出DNA条带,即未能形成稳定的供受者混合嵌合体;输注6×107个C57BU6JJ小鼠脾细胞组移植组2、5、8周可检测出较亮的DNA条带,但在第12周检测出和输注6×107、9×107个Balb/c小鼠脾细胞组亮度相似的条带,即起初形成高水平的供受者混合嵌合体,嵌合水平随时间的推移而降低。（2）根据慢性GVHD的病理评分标准确定各组小鼠的患病状态,对皮肤改变、体重减轻、腹泻和弓背体态四项观察指标进行二分类Logistic回归危险度分析显示,模型似然比检验P=0.041,回归方程有统计学意义:按P≤0.05与发病关系密切的变量是皮肤改变和体重减轻,Ps=0.000,Pw=0.037;以预测概率0.05为判别分界点,总判对率为95.8%。因此,皮肤改变和体重减轻是本模型较为敏感的临床观察指标。（3）各组小鼠的临床表现:输注不同数量Balb/c小鼠脾细胞后,各组受鼠出现不同程度的慢性GVHD的表现,输注等体积的RPMI1640的受鼠未出现慢性GVHD的表现,输注C57BL/6JJ小鼠脾细胞组最初出现急性GVHD的表现,但小鼠并未死亡,后期则出现慢性GVHD的表现;log-rank检验A、B、C实验组和对照组发病率的Kaplan生存曲线差别有统计学意义（P=0.000）,按校正后的检验水准P≤0.0071,B、C实验组和对照组之间差别均有统计学意义（P=0.000）,A实验组和对照组之间差别无统计学意义（P=0.032）,B、C实验组和A实验组之间差别均有统计学意义（P=0.000）,B、C实验组之间差别无统计学意义（P=0.302）;以H检验比较A、B、C组小鼠GVHD的严重程度差别有统计学意义（P=0.015）,按校正后的检验水准P≤0.0125,A、B实验组之间差别有统计学意义（P=0.004）,A、B实验组和C实验组之间差别均无统计学意义（P≥0.015）;A、B、C组小鼠皮肤改变评分和体重减轻评分的差别均无统计学意义（P≥0.199）。根据慢性GVHD的临床评价标准,输注6×107、9×107个Balb/c小鼠脾细胞组成功的诱导出了慢性GVHD,输注6×107组临床表现最典型。（4）各组小鼠的病理表现:输注后100天,断颈处死所有小鼠,A、B、C组受鼠检测出不同程度的慢性GVHD的病理损害,各组慢性GVHD的发生率分别为4/12、11/12、11/12,输注等体积的RPMI1640的受者未检测出慢性GVHD的病理损害,输注C57BL/6JJ小鼠脾细胞组早期出现急性GVHD的病理损害（行嵌合体分析小鼠的病理标本）,输注后100天则检测出慢性GVHD的病理损害。根据慢性GVHD的评价标准,对肝脏、皮肤和小肠的病理表现评分,以H检验比较A、B、C组小鼠GVHD的严重程度差别有统计学意义（P=0.024）,按校正后的检验水准P=0.0125,A、B实验组之间差别有统计学意义（P=0.010）,A、B实验组和C实验组之间差别均无统计学意义（P≥0.023）;A、B、C组小鼠肝脏、皮肤和小肠病理改变的严重程度差别均无统计学意义（P≥0.070）。根据慢性GVHD的病理评价标准,输注6×107、9×107个Balb/c小鼠脾细胞组成功的诱导出了慢性GVHD,输注6×107组病理表现最典型。2.体内观察阻断CD4+T细胞活化的双信号系统对小鼠慢性GVHD的影响。（1）嵌合体检测:输注6×107个Balb/c小鼠脾细胞后,cGVHD组和TJU103、CTLA4-Ig、TJU103+CTLA4-Ig组在2、5、8、12周均可检测出较为均一的DNA条带,即形成了较为稳定的供受者混合嵌合体。（2）慢性GVHD动物模型的重复性检验:log-rank检验建模实验中输注6×107Balb/c小鼠脾细胞组和本章实验中cGVHD组Kaplan生存曲线差别无统计学意义（P=0.155）;两独立样本非参数检验比较两组样本GVHD临床表现、体重减轻、皮肤改变的严重程度差别无统计学意义（P≥0.143）;两独立样本非参数检验比较两组样本GVHD病理改变、皮肤损害、肝脏损害和肠道损害的严重程度差别无统计学意义（P≥0.061）。因此输注6×107Balb/c小鼠脾细胞至CB6F1小鼠所诱导的慢性GVHD具有较好的重复性。（3）各组小鼠的临床表现:输注不同数量Balb/c供鼠脾细胞后,各组受鼠观察到不同程度的慢性GVHD的临床表现,输注等体积的RPMI1640的受者未观察到慢性GVHD的临床表现。log-rank检验Kaplan生存曲线差别有统计学意义（P=0.000）,按校正后的检验水准P≤0.0045,cGVHD、TJU103组和对照组之间差别均有统计学意义（P=0.000）,CTLA4-Ig、TJU103+CTLA4-Ig组和对照组之间差别均无统计学意义（P≥0.032）;cGVHD组和TJU103、CTLA4-Ig、TJU103+CTLA4-Ig组之间差别均有统计学意义（P=0.000）;按校正后的检验水准P≤0.0071,以H检验比较各组小鼠GVHD的严重程度、皮肤改变评分和体重减轻评分差别无统计学意义（P≥0.218）。因此,TJU103、CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig均可改变慢性GVHD的发病率的Kaplan生存曲线,分析其生存曲线,CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig降低了慢性GVHD的发病率（慢性GVHD组的发病率为12/12,CTLA4-Ig组的发病率为4/12,TJU103+CTLA4-Ig组的发病率为2/12）,TJU103延缓了慢性GVHD的发病时间（慢性GVHD组的中位发病时间为6.8周,TJU103组的中位发病时间为11周）;TJU103、CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig均不能改变慢性GVHD的严重程度。（4）各组小鼠的病理表现:输注不同数量Balb/c小鼠脾细胞后,各组受鼠检测到不同程度的慢性GVHD的病理损害,cGVHD组和TJU103、CTLA4-Ig、TJU103+CTLA4-Ig组小鼠慢性GVHD的发生率为12/12、9/12、4/12和2/12,输注等体积的RPMI1640的受者未出现慢性GVHD的病理损害。以H检验比较上述各组小鼠慢性GVHD的严重程度差别有统计学意义（p=0.019）,但是,按校正后的检验水准P≤0.0071,上述各组组间比较差别无统计学意义（P≥0.027）;各组小鼠肝脏和肠道病理改变的严重程度差别均无统计学意义（P≥0.183）;各组小鼠皮肤病理改变的严重程度差别有统计学意义（P=0.010）,但是,按校正后的检验水准P≤0.0071,上述各组组间比较差别无统计学意义（P≥0.012）。3.体内观察阻断CD4+T细胞活化的双信号系统对GVL效应的影响。腹腔接种FBL-3细胞后,观察各组小鼠的生存期,空白对照组的平均生存时间为800±1.00天,慢性GVHD组的平均生存时间为6.42±0.55天,TJU103组的平均生存时间为9.20±1.30天,CTLA4-Ig组的平均生存时间为11.00±1.26天,TJU103+CTLA4-Ig组的平均生存时间为15.40±1.52天,单因素方差分析比较各组小鼠的平均生存时间差别有统计学意义（F=43.897 P=0.000）,以LSD法进行组间比较,TJU103组和对照组之间差别无统计学意义（P=0.119）,其余各组组间差别均有统计学意义（P≤0.042）。取频死小鼠行病理学检查,肝脏表面可见明显的肿块结节,部分小鼠肺组织塌陷:镜下HE染色可见肝、脾、肺组织及骨髓白血病细胞弥漫性浸润,主要为幼稚细胞,正常组织结构严重破坏。4.单向混合淋巴细胞培养（MLC）体外监测各组小鼠T淋巴细胞的增殖效应、对MHC单倍体相合移植物的杀伤效应和对红白血病细胞的杀伤效应。析因设计资料方差分析35天和85天各组小鼠脾细胞刺激宿主T淋巴细胞的增殖效应,不同组别间、不同时间点间差异均有统计学意义(Fgroup=402.297Pgroup=0.000,Ftime=22.355 Ptime=0.000),组别和时间点之间的交互效应显著(Finteraction=17.432 Pinteraction=0.000)。数据满足方差齐性要求,LSD法检测各组增值率的组间差异,在第35天,TJU103组和CTLA4-Ig组差异无统计学意义（P=0.064）,其余各组差异均具有统计学意义（P=0.000）;在第85天,TJU103组和cGVHD组、CTLA4-Ig组和TJU103+CTLA4-Ig组差异无统计学意义（P≥0.425）,其余各组差异均具有统计学意义（P=0.000）;独立样本t检验分析各组35天、85天增值率,对照组、cGVHD组和CTLA4-Ig组差异无统计学意义（P≥0.155）,TJU103组和TJU103+CTLA4-Ig组差异有统计学意义（P≤0.001）。析因设计资料方差分析35天和85天各组小鼠脾细胞刺激宿主T淋巴细胞的对MHC单倍体相合移植物的杀伤效应差异均有统计学意义(F35=107.260P35=0.000,F85=85.821 P85=0.000);数据满足方差齐性,LSD法检测各组杀伤率的组间差异,在第35天,TJU103组和CTLA4-Ig组差异无统计学意义（P=0.909）,其余各组差异均具有统计学意义（P≤0.005）;在第85天,TJU103组和cGVHD组差异无统计学意义（P=0.614）,其余各组差异均具有统计学意义（P=0.000）。以上结果发现:TJU103早期抑制T淋巴细胞增殖的效应同CTLA4-Ig相当（0.3610±0.0213 vs 0.3296±0.0335）,抑制供者T淋巴细胞对MHC单倍体相合移植物的杀伤效应同CTLA4-Ig相当,而后期抑制T淋巴细胞增殖的效应减弱,其淋巴细胞增殖效应同慢性GVHD组相当（0.4988±0.0202 vs0.5076±0.0307）.对MHC单倍体相合移植物的杀伤效应增强,同慢性GVHD组水平相当,即TJU103体内抑制T淋巴细胞增殖及抑制供者T淋巴细胞对宿主的杀伤效应均经历了由强到弱的过程;而在T+C联合组,T淋巴细胞增殖效应也经历了类似的由强到弱的过程（0.2188±0.0138 vs 0.30304±0.0312）。析因设计资料方差分析35天和85天各组小鼠脾细胞刺激T淋巴细胞的对小鼠红白血病细胞的杀伤效应差异均无统计学意义(F35=0.254 P35=0.904,F85=0.026 P85=0.999);不同效靶比之间差别有统计学意义(F35=58.757 P35=0.000,F85=29.188P85=0.000);分组和效靶比之间交互效应不显著(F35=0.393 P85=0.969,F85=0.097P35=1.000),因此,各组小鼠脾细胞刺激T淋巴细胞的对小鼠红白血病细胞的杀伤效应无明显差异。结论:1.输注6×107和9×107个Balb/c供鼠脾细胞的受鼠鼠成功建立了MHC单倍体相合供者淋巴细胞输注诱导的慢性移植物抗宿主病;毛发改变和体重减轻是敏感的临床评价指标,肝脏、皮肤和肠道是敏感的病理评价指标;模型组具有较好的可重复性。2.应用TJU103阻断CD4-T细胞活化的第一信号可推迟慢性GVHD的发病时间,应用CTLA4-Ig阻断CD4-T细胞活化的共刺激信号可降低慢性GVHD的发生率,联合应用TJU103和CTLA4-Ig可降低慢性GVHD的发生率的作用更加明显。3.移植后100天腹腔接种小鼠红白血病细胞后,慢性GVHD缩短了小鼠的生存时间;TJU103干预组和空白对照对照组的生存时间差别无统计学意义,CTLA4-Ig组和TJU103+CTLA4-Ig组明显的延长了荷红白血病小鼠的生存时间,以后者效应最强。4.TJU103、CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig均可抑制T淋巴细胞的增殖和对MHC单倍体相合同种异体移植物的杀伤效应,其中TJU103的抑制效应经历了从强到弱的转变;TJU103、CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig对红白血病细胞杀伤效应无明显影响。本研究的创新点:建立了MHC单倍体相合供者淋巴细胞输注诱导的慢性GVHD动物模型;在上述模型的基础上证实了TJU103可推迟慢性GVHD的发病时间,CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig可减少慢性GVHD的发生率,CTLA4-Ig和TJU103+CTLA4-Ig可延长荷白血病小鼠的生存时间,首次发现慢性GVHD缩短了荷红白血病小鼠的生存时间,并初步证实TJU103推迟慢性GVHD的发病时间与其细胞动力学变化有关。研究价值:本研究为临床建立慢性GVHD的预防和治疗方案进行了临床前研究,为认识T细胞活化在慢性GVHD发生中的作用进行了初步探讨,为临床建立和优化慢性GVHD的预防和治疗方案提供了实验依据。
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