稻瘟病菌中分支酸变位酶（MoCM）的功能分析

论文摘要

分支酸(chorismic acid)是植物和微生物莽草酸代谢途径的终产物,同时也是许多化合物的前体。除水杨酸(salicylic acid, SA)、植物生长素吲哚乙酸(indoleacetic acid, IAA)等植物防御相关的有机物外,也能合成芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)及其他的次生代谢产物。分支酸变位酶(chorismate mutase, CM)作为莽草酸途径的一部分,它能催化底物分支酸通过中柱鞘中克莱森重排的周环反应(pericyclic claisen rearrangement)转变成预苯酸,为苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成提供前体。由于分支酸变位酶是芳香族氨基酸代谢过程中必不可少的酶,已经在许多的生物体中被广泛研究。这其中包括Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago maydis, Arobidopsis thaliana, Meloidogyne javanica等。令人惊讶的是分支酸变位酶作为基本代谢途径中必需的酶,在专性寄生、活体营养和半活体营养型致病真菌中能通过影响宿主植物细胞的生长发育而成功定殖扩展。本研究试图了解稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中分支酸变位酶的功能。首先利用稻瘟病菌基因组数据库和相关的生物信息学软件对基因进行横纵向分析,结果表明在稻瘟病菌基因组中只存在一个分支酸变位酶,定义为MoCM。然后利用同源重组的遗传学方法,对目的基因进行敲除。突变体基本表型分析发现,相比于野生型ΔKu80,其气生菌丝明显减少,产孢量、穿透率均下降,孢子的萌发和附着胞的形成延迟,以及对洋葱的侵染能力下降。这些结果表明,分支酸变位酶不仅影响稻瘟病菌的营养生长,对宿主细胞的致病性也下降。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一、引言
• 1. 稻瘟病菌的研究进展
• 1.1 稻瘟病菌的研究背景及重要性
• 1.2 稻瘟病菌的侵染循环过程
• 1.3 稻瘟病菌的国内外研究现状
• 1.4 稻瘟病菌效应子的研究现状
• 2. 分支酸变位酵的研究进展
• 2.1 分支酸变位酶的反应机制及其在莽草酸途径中的作用
• 2.2 分支酸变位酶家族的结构和功能分类
• 2.3 分支酸变位酶在不同生物体的功能和结构分析
• 2.3.1 分支酸变位酶在细菌中的研究
• 2.3.2 分支酸变位酶在真核细胞中的研究
• 2.3.3 分支酸变位酶在植物中的研究
• 2.3.4 分支酸变位酶在寄生线虫中的研究
• 2.3.5 分支酸变位酶在致病性真菌中的研究
• 3. 本研究的意义
• 二、材料方法
• 1. 材料
• 1.1 实验质粒、菌株
• 1.2 植物材料
• 1.3 培养基
• 1.4 生化试剂
• 2 方法
• 2.1 生物信息学分析
• 2.1.1 分支酸变位酶蛋白序列获得与分析
• 2.1.2 分支酸变位酶进化关系分析
• 2.2 PCR扩增目的片段与SOE-PCR获得转化片段
• 2.2.1 本实验PCR所采用的引物序列及用途
• 2.2.2 目的片段的扩增和同源片段的拼接
• 2.3 稻瘟病菌原生质体的制备
• 2.4 稻瘟病菌原生质体转化
• 2.5 稻瘟病菌基因组DNA的提取及提取质量检测
• 2.6 稻瘟病菌菌丝体total RNA的提取及RT-PCR
• 2.6.1 稻瘟病菌菌丝体total RNA的提取
• 2.6.2 RT-PCR得到第一链cDNA
• 2.7 稻瘟病菌互补载体的构建
• 2.7.1 质粒酶切与连接
• 2.7.2 感受态细胞的转化
• 2.7.3 质粒DNA的提取
• 2.8 Southern blot验证ΔMoCM和MoCM-Com
• 2.9 稻瘟病菌敲除突变体的基本表型分析
• 2.9.1 稻瘟病菌生长速率的测定
• 2.9.2 稻瘟病菌产孢量统计和细胞形态观察
• 2.9.3 孢子萌发及附着胞形成实验
• 2.9.4 洋葱表皮内侵染结构观察
• 2.9.5 致病性分析
• 2.9.5.1 大麦致病性分析
• 2.9.5.2 水稻致病性分析
• 三、结果与分析
• 1. 稻瘟病菌MoCM的生物信息学分析
• 1.1 稻瘟病菌MoCM功能域的保守性验证
• 1.2 真菌中CM的进化关系分析
• 2 MoCM敲除突变体及其互补菌株的获得
• 2.1 敲除突变体的获得
• 2.1.1 ΔMoCM的筛选与PCR验证
• 2.1.2 RT-PCR分析ΔMoCM中CM的表达量
• 2.2 互补突变体菌株的筛选与验证
• 2.3 Southern blot验证ΔMoCM和MoCM-Com
• 3 敲除突变体菌株和互补菌株的基本表型分析
• 3.1 MoCM敲除突变体影响稻瘟病菌气生菌丝的形态
• 3.2 MoCM敲除突变体影响稻瘟病菌分生孢子梗的数量
• 3.3 MoCM的敲除使孢子的萌发和附着胞形成延迟及穿透率的下降
• 3.4 致病性分析
• 3.4.1 洋葱表皮侵染实验
• 3.4.2 大麦离体接种致病性分析
• 3.4.3 水稻喷雾接种致病性分析
• 4. 带有GFP、mCherry+NLS荧光标签的互补菌株中MoCM蛋白的亚细胞定位
• 四、结论与讨论
• 1 稻瘟病菌中MoCM蛋白特性的分析
• 1.1 不同真菌中MoCM蛋白的进化关系比较
• 1.2 MoCM蛋白的对稻瘟病菌生长发育的影响
• 1.3 MoCM蛋白对稻瘟病菌致病性的影响
• 2 后续实验
• 3 研究的意义及展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢