利用荧光原位杂交技术研究棉花基因组的组成及进化

论文摘要

棉花是我国乃至世界上最重要的纤维经济作物。棉属包括4个栽培种和46个野生种,分属于A、B、C、D、E、F、G、K和AD基因组。如此丰富的种质资源为棉花的遗传学研究提供了大量的可试材料,然而,对于明确棉花种间亲缘关系及演化规律的研究,这样数量之多的棉花种类也使研究工作变得更加复杂。此外,棉花染色体普遍存在数量大,形态小,彼此缺乏差异等特点,使染色体的准确快速识别无法实现,这为开展棉花在细胞遗传学领域的研究工作带来了一定的困难。荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）技术的诞生在很大程度上为我们解决了上述困难。并因其具有检出快速,灵敏度高,应用广泛等优势迅速成为分子细胞遗传学研究的一项重要工具。本文主要利用了FISH的衍生技术:BAC-FISH、GISH（Genomic in situ hybridization,GISH）和多色GISH（Multi-color GISH,McGISH）技术对栽培种亚洲棉（Gossypium arboreu）开展了分子细胞遗传学研究,同时也进行了二倍体野生棉与异源四倍体陆地棉（Gossypium hirsutum accession（acc.））的亲缘关系分析。研究结果对于阐明棉花基因组组成,遗传进化和亲缘关系,实现棉花遗传改良具有重要的理论和实践意义。主要研究内容如下:1.利用BAC-FISH技术进行亚洲棉染色体核型分析:基于前期的研究结果,从江陵中棉（G.arboreum cv.JLZM）、陆地棉TM-1（G.hirsutum acc.TM-1）和恢复系0-613-2R BAC文库中筛选了20个特异BAC克隆,这些BAC克隆在FISH杂交中不产生或存在很低的背景干扰。再加上45s和5s rDNA,最终含有22个克隆的一套探针组合被成功开发,并将亚洲棉26条染色体同时准确识别出来。依据亚洲棉与四倍体棉的同源性关系,对应于陆地棉A亚组的命名A1-A13,亚洲棉26条染色体相应地被指定命名为A1-A13。同时,在成功地构建了一套可以准确识别亚洲棉26条染色体的BAC克隆群的基础上,创建了一个基于FISH技术的亚洲棉核型分析方法。将亚洲棉13条有丝分裂中期染色体长度按递减的顺序重新排列为:A5（包括rDNA部分）,A7（包括rDNA部分）,A3,A4,A6,A1,A12,A2,A10,A8,A13,A11,和A9。BAC-FISH技术成功实现了染色体的同步识别,并充分显示了其在棉花细胞遗传学研究中的绝对优势。2.多色基因组荧光原位杂交技术体系的建立:采用陆地棉（G.hirsutum L.）标准系TM-1体细胞有丝分裂中期染色体为靶DNA,以野生种斯特提棉（G.sturtianumWillis）为探针,通过提高封阻DNA与探针浓度比例、洗脱液中甲酰胺浓度、洗脱温度、延长洗脱时间等条件,以增强DNA杂交反应的严谨性,使靶标中刚刚没有杂交信号为止。结果,封阻DNA与探针之比为100:1、洗脱液中甲酰胺浓度提高至60%、洗脱温度升高到43℃、洗脱时间延长至13min时,TM-1的靶标染色体上无杂交信号,而以TM-1与斯特提棉杂种F1（基因组组成为AtDtC1）体细胞有丝分裂中期DNA为靶标,则可清晰地将斯特提棉的C1基因组染色体与陆地棉基因组染色体鉴别出来,建立了棉花外源染色体精准鉴定的基因组原位杂交（GISH）技术体系。并在此基础上,以A1基因组的阿非利加非洲棉（G.herbaceum var.africanum）和C1基因组的斯特提棉两个棉种的DNA同时为探针,可以清晰地区分At、Dt和C1基因组染色体,且重复性好,建立了棉花多色GISH技术体系,并成功应用于种间杂种的鉴定。对引自澳大利亚CSIRO的陆地棉与澳洲棉（G.austral F.v M.）（基因组组成G2G2）六倍体杂种（基因组组成AtAtDtDtG2G2）进行了多色GISH杂交,可清晰地区分At、Dt和G2基因组染色体。为渐渗系中的外源DNA片段及其整合方式提供了技术支持。3.利用GISH技术研究棉花物种进化:选择了11个D染色体组的二倍体野生棉用于与陆地棉（G.hirsutum L）TM-1 GISH杂交以探讨四倍体棉D染色体亚组供体种问题,这11个D组野生二倍体棉分别是戴维逊氏棉（G.davidsonii）、雷蒙得氏棉（G.raimondii）、瑟伯氏棉（G.thurberi）,拟似棉（G.gossypiodies）、辣根棉（G.armourianum）、三裂棉（G.trilobum）、松散棉（G.laxum）、哈克尼西棉（G.harknessii）、施沃恩蒂曼氏棉（G.schwendimanii）、裂片棉（G.lobatum）和克劳茨基棉（G.klotzschianum）。结果显示,三裂棉的杂交信号最强且信号覆盖度最大,由此推测三裂棉与陆地棉染色体亚组的同源性最高,这一发现为陆地棉的起源与进化的研究提供了新的证据。另一方面,分别选择了分属于B、C、E、F和G染色体组的异常棉（G.anomalum）、斯特提棉（G.sturtianum）、索马里棉（G.somalense）、长萼棉（G.longicalyx）和澳洲棉（G.australe）来用于研究二倍体野生棉与陆地棉亲缘关系。异常棉、斯特提棉、索马里棉和长萼棉都与陆地棉A染色体亚组产生强烈的红色信号,澳洲棉相对较弱。另外,斯特提棉是唯一的一个在D亚组显现信号的探针,预示着其包含的重复序列可能具有自身特异性。整体分析说明,B、C、E、F和G染色体组与陆地棉A染色体亚组的亲缘关系近于D染色体亚组。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文所用主要缩略词
• 第一篇 文献综述
• 第一章 荧光原位杂交技术
• 1 荧光原位杂交技术的发展
• 2 荧光原位杂交技术简介
• 2.1 染色体原位杂交的靶DNA
• 2.1.1 早中期和中期染色体
• 2.1.2 花粉母细胞减数分裂粗线期染色体
• 2.1.3 间期细胞核染色质
• 2.1.4 游离的染色质
• 2.1.5 DNA纤维
• 2.1.6 流式分拣染色体
• 2.2 探针的制备
• 2.2.1 探针的标记方法
• 2.2.2 FISH技术中标记物种类（荣红颖等,2007）
• 2.2.3 探针的类型
• 2.3 染色体原位杂交基本程序
• 2.4 荧光显微镜检测
• 第二章 FISH及其衍生技术在植物基因组研究中的应用
• 1 基于FISH的衍生技术介绍
• 2 荧光原位杂交技术在植物学研究中的应用
• 2.1 基因的物理定位及其在植物育种中的应用
• 2.2 染色体物理图谱的构建
• 3 BAC-FISH在棉花基因组研究中的应用
• 3.1 BAC-FISH技术介绍
• 3.2 BAC-FISH技术的优势
• 3.3 BAC-FISH在棉花基因组研究中的应用
• 3.3.1 棉花连锁群的BAC-FISH定位
• 3.3.2 棉花染色体的识别及其遗传图谱与物理图谱的比较作图分析
• 4 GISH在植物基因组研究中的应用
• 4.1 GISH技术简介
• 4.2 GISH在植物基因组研究中的应用
• 4.2.1 杂种染色体组成分析
• 4.2.2 物种间同源性的比较分析
• 第二篇 研究报告
• 第三章 利用BCA-FISH技术进行亚洲棉A染色体组的核型分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 SSR标记的确定及文库筛选
• 1.3 染色体制片及荧光原位杂交
• 1.3.1 染色体制片
• 1.3.2 探针的制备及杂交液的配制
• 1.3.3 原位杂交
• 1.3.4 信号检测
• 1.3.5 重复荧光原位杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 22个染色体特异SSR标记及克隆的鉴定
• 2.2 二倍体亚洲棉26条染色体的同步识别
• 2.3 染色体核型分析
• 2.4 两对易位染色体的鉴定
• 3 讨论
• 3.1 亚洲棉染色体的核型分析
• 3.2 rDNA-FISH技术在棉花进化研究中的应用
• 3.3 遗传图谱与物理图谱的比较分析
• 第四章 多色基因组荧光原位杂交技术体系的建立及其应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 染色体制片
• 1.2.2 探针的制备与标记
• 1.2.3 杂交液的配制
• 1.2.4 荧光原位杂交
• 1.2.5 洗脱及信号检测
• 2 结果与分析
• 2.1 棉花GISH技术体系的改进
• 2.2 棉花Multi-color GISH技术体系的建立及其在种间杂种染色体组成分析中的应用
• 3 讨论
• 第五章 陆地棉起源与演化的GISH研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 陆地棉起源与演化研究的供试材料
• 1.1.2 陆地棉与二倍体野生棉亲缘关系研究的供试材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 陆地棉起源与演化研究的结果分析
• 2.2 陆地棉与二倍体野生棉亲缘关系研究的结果与分析
• 3 讨论
• 3.1 野生二倍体A,D染色体组与陆地棉相似性的比较分析
• 3.2 关于四倍体棉D染色体组供体种的初步探讨
• 3.3 棉花不同染色体组间基因入侵现象
• 3.4 关于陆地棉与其它染色体组二倍体棉种亲缘关系的讨论
• 3.5 GISH技术自身问题的探讨
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢