中性植酸酶产生菌的筛选及基因工程菌的构建

论文摘要

中性植酸酶不仅具有较好的热稳定性,有助于抵抗饲料制粒过程中高温引起的酶失活,而且其酶促反应最适pH在7.0-7.5之间,可有效弥补酸性植酸酶的不足。本研究筛选了中性植酸酶产生菌,优化了其液态产酶参数,克隆与分析了其基因,在此基础上,构建了中性植酸酶原核和真核表达基因工程菌,旨在为中性植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下：1.中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及其液态产酶参数优化通过平板初筛和摇瓶复筛,从土壤中筛选出6株能够分泌中性植酸酶的菌株,其中菌株ZJ-6显示较高的活力。经鉴定表明,菌株ZJ-6为地衣芽孢杆菌,其液态发酵产酶培养基中最佳碳源为l%葡萄糖,氮源为0.1%硫酸铵,初始pH为7.5,最佳培养温度为55℃。经36h培养后,产酶水平达到最高,酶活为0.267U/ml,比活为0.701U/mmg。2.地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶基因克隆及序列分析通过PCR对地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶基因（phyC）进行扩增,获得一段长约1.2kb的特异性产物,并将其克隆到pUCmT载体,构建含有目的基因片段的重组质粒pUCm-T phyC。序列分析表明,phyC基因全长1146bp,编码381个氨基酸,5’端有一段编码31个氨基酸的信号肽序列；不含有酸性植酸酶蛋白中均存在的高度保守的RHGXRXP和HD序列；与已报道的地衣芽孢杆菌（AY651979）、凝结芽孢杆菌（DQ346195）、枯草芽孢杆菌（AJ277890）、淀粉液化芽孢杆菌（AY836773）和芽孢杆菌sp.DSl1（BSU85968）中性植酸酶核苷酸同源性分别为99%、70%、67%、67%和67%,与所编码蛋白同源性分别为99%、69%、65%、65%和64%。该酶蛋白成熟肽二级结构中无规卷曲占57.42%,折叠占40.29%,α-螺旋占2.29%；其三级结构与模板蛋白lh61A（1.8A）同源性为68.2%。3.中性植酸酶基因工程菌株的构建将地衣芽孢杆菌ZJ-6编码的中性植酸酶基因（phyC）定向插入到原核表达载体pET-30a（+）上,获得的重组质粒phyC-pET-30a（+）在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,表达产物（EPhyC5）经Ni-NTA亲和层析纯化后比活为2.87U／mg。SDS-PAGE表明,EPhyC5相对分子量为42.86 kDa。将地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶成熟肽基因（phyCm）以N-端融合方式插入到酵母表达载体pPIC9K上的α-因子信号肽编码序列的3’端,构建重组质粒pPIC9K-phyCm,电击法转化毕赤氏酵母GS1 15。经MD／MM平板筛选、G418抗性筛选和酶活性测定,获得20个阳性表达子（pPhyCm）,其中pPhyCm6活性最高。将pPhyCm6接种于BMMY培养基中,经0.5%甲醇诱导培养96h,发酵上清液中重组中性植酸酶（PPhyCm6）比活为8.64U／mmg。SDS-PAGE结果表明,PPhyCm6相对分子量为38.78kDa,与理论推算的分子量（38.7kDa）相吻合。在巴斯德毕赤氏酵母中实现了有生物学活性中性植酸酶的分泌表达。4.重组酶及其亲本酶的酶学性质分析野生酶PhyC最适温度和最适pH分别为55℃和7.0；在80℃、pH7.0条件下处理10 min,残余酶活为57.36%；在pH6.5-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。EPhyC5最适温度和最适pH分别为60℃和7.0；在80℃、pH7.0条件下处理10 min,残余酶活为68.26%；在pH6.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。PPhyCm6最适温度和最适pH分别为60℃和7.5；在80℃、pH7.5条件下处理2 min,残余酶活为59.42%；在pH5.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。重组酶EPhyC5和PPhyCm6在离子影响、底物特异性和Ca2+依赖性方面与亲本酶PhyC基本一致。EDTA、Cu2+、Cd2+、Ba2+和Mn2+对酶活性均有显著抑制作用；1.0mmol/LCa2+能提高酶蛋白的热稳定性和pH稳定性；植酸钠是特异性作用底物；氟化钠和钒酸铵均能引起酶活性降低。酶学性质

论文目录

中文摘要

Abstract

主要英文缩写与译名

引言

第一章文献综述

第一节植酸的特性

1 植酸的理化特性

2 植酸的分布

3 植酸的抗营养作用

3.1 植酸-金属离子复合物的抗营养效应

3.2 植酸-蛋白质复合物的抗营养效应

3.3 磷资源的浪费与环境污染

3.4 植酸对消化酶的抑制作用

3.5 其它危害

第二节中性植酸酶的来源及其酶学性质

1 中性植酸酶的来源

2 中性植酸酶的酶学性质

2.1 一般酶学性质

2.2 中性植酸酶的热稳定性

2.3 内源酶对中性植酸酶的影响

2.4 中性植酸酶的底物特异性

第三节中性植酸酶的结构及其催化机理

1 中性植酸酶的基因结构

2 中性植酸酶的晶体结构

2.1 整体结构与空间构象

2+及其功能'>2.2 芽孢杆菌中性植酸酶分子中的Ca²⁺及其功能

3 中性植酸酶的催化机制

第四节中性植酸酶基因的表达

1 中性植酸酶基因在大肠杆菌中的表达

2 中性植酸酶基因在芽孢杆菌中的表达

3 中性植酸酶基因在酵母中的表达

4 中性植酸酶基因在植物中的表达

第五节中性植酸酶的应用

1 中性植酸酶在饲料工业中的应用

1.1 提高植酸磷的利用率,减轻水环境污染

1.2 提高矿物元素的生物利用率

1.3 提高鱼类对蛋白质及脂肪的利用率

1.4 降低植酸盐的抗营养作用的同时提供营养物质

2 中性植酸酶在食品工业中的应用

3 中性植酸酶在医药工业中的应用

4 影响中性植酸酶应用的因素

4.1 中性植酸酶的添加水平

4.2 中性植酸酶的添加方式

4.3 饲料中营养成分的影响

2+的依赖性'>第六节中性植酸酶对Ca²⁺的依赖性

2+对中性植酸酶催化活性的影响'>1 Ca²⁺对中性植酸酶催化活性的影响

2+参与降解复合物的形成'>1.1 Ca²⁺参与降解复合物的形成

2+对植酸降解的影响'>1.2 Ca²⁺对植酸降解的影响

2+和植酸对植酸降解的影响'>1.3 过量Ca²⁺和植酸对植酸降解的影响

2+对中性植酸酶蛋白空间构象的影响'>2 Ca²⁺对中性植酸酶蛋白空间构象的影响

第二章研究报告

第一节中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及其酶学性质分析

试验一产中性植酸酶微生物的筛选及鉴定

1 试验材料

2 试验方法

2.1 中性植酸酶产生菌的筛选

2.2 中性植酸酶的制备及测定方法

2.3 菌体形态学观察

2.4 理化性质分析

2.5 16S rRNA序列分析

2.6 数据处理与统计分析

3 结果与分析

3.1 菌株的筛选

3.2 培养特征和形态学观察

3.3 理化性质分析

3.4 16S rRNA序列分析

4 讨论

试验二地衣芽孢杆菌ZJ-6液态发酵产酶条件的研究

1 试验材料

2 试验方法

2.1 菌株产酶条件的优化

2.2 数据处理与统计分析

3 结果与分析

3.1 不同氮源对产酶的影响

3.2 不同碳源对产酶的影响

3.3 初始pH对产酶的影响

3.4 培养温度对产酶的影响

3.5 菌株生长及产酶进程

4 讨论

试验三地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶部分酶学特性分析

1 试验材料

2 试验方法

2.1 地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶的制备及测定方法

2.2 地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶部分酶学特性分析

3 结果与分析

3.1 温度对地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶活性的影响

3.2 pH对地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶活性的影响

3.3 金属离子和部分有机化学试剂对地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶活性的影响

3.4 地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶底物特异性分析

3.5 氟化钠和钒酸铵对地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶活性的影响

4 讨论

小结

第二节地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶基因克隆及序列分析

1 试验材料

2 试验方法

2.1 地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶基因的克隆

2.2 割胶回收及DNA片段的连接

2.3 感受态细胞E.coli TOP10F’的制备与转化

2.4 重组质粒的提取及阳性克隆子的鉴定

2.5 测序及分析

3 结果与分析

3.1 PCR结果

3.2 阳性克隆子的筛选与鉴定

3.3 序列分析

3.4 结构预测

4 讨论

小结

第三节中性植酸酶基因phyC在大肠杆菌中的表达及重组酶特性分析

试验一中性植酸酶基因phyC在大肠杆菌中的表达

1 试验材料

2 试验方法

2.1 中性植酸酶基因的亚克隆

2.2 重组质粒的酶切

2.3 表达载体的酶切

2.4 重组质粒与表达载体的连接

2.5 感受态细胞Ecoli BL21的制备与转化

2.6 阳性转化子的筛选

2.7 阳性表达子的筛选

3 结果与分析

3.1 中性植酸酶基因phyC的扩增

3.2 阳性克隆子筛选与鉴定

3.3 重组质粒pUCm-phyC的提取与双酶切

3.4 pET-30a（+）表达载体的的提取与双酶切

3.5 重组质粒pET-30a（+）-phyC的PCR和酶切鉴定

3.6 中性植酸酶基因阳性表达子的酶活测定

4 讨论

试验二重组中性植酸酶EPhyC5酶学特性研究

1 试验材料

2 试验方法

2.1 基因工程菌的培养

2.2 表达产物的纯化

2.3 酶活测定及酶学特性分析

2.4 SDS-PAGE凝胶电泳试剂配制

2.5 SDS-PAGE分析

3 结果与分析

3.1 重组中性植酸酶EPhyC5的纯化及SDS-PAGE分析

3.2 温度对重组中性植酸酶EPhyC5活性的影响

3.3 pH对重组中性植酸酶EPhyC5活性的影响

3.4 金属离子和部分有机化学试剂对重组中性植酸酶EPhyC5活性的影响

3.5 大肠杆菌重组中性植酸酶EPhyC5底物特异性分析

3.6 氟化钠和钒酸铵对重组中性植酸酶EPhyC5的影响

4 讨论

小结

第四节中性植酸酶成熟肽phyCm在毕赤氏酵母中的分泌表达及酶学性质研究

试验一中性植酸酶成熟肽基因phyCm在毕赤氏酵母中的表达

1 试验材料

2 试验方法

2.1 中性植酸酶成熟肽的亚克隆

2.2 pPIC9K的提取和双酶切

2.3 pPIC9K-phyCm质粒的构建

2.4 pPIC9K-phyCm质粒的大量提取

2.5 pPIC9K-phyCm质粒线性化及浓缩

2.6 毕赤氏酵母GS115感受态细胞的制备

2.7 电击转化

2.8 酵母转化子的筛选和培养

2.9 酵母阳性转化子的PCR鉴定

2.10 阳性表达子的筛选

3 结果与分析

3.1 中性植酸酶成熟肽phyCm的亚克隆

3.2 阳性克隆子筛选与鉴定

3.3 pPIC9K-phyCm质粒的构建

3.4 pPIC9K-phyCm质粒的提取和线性化

3.5 电击转化和阳性转化子的筛选

3.6 酵母阳性表达子的筛选

4 讨论

试验二重组中性植酸酶PPhyCm6酶学性质分析

1 试验材料

2 试验方法

2.1 重组中性植酸酶的纯化

2.2 蛋白质含量测定

2.3 活性测定及酶学性质分析

2.4 SDS-PAGE分析

3 结果与分析

3.1 重组中性植酸酶PPhyCm6的纯化及SDS-PAGE分析

3.2 温度对重组中性植酸酶PPhyCm6活性的影响

3.3 pH对重组中性植酸酶PPhyCm6活性的影响

3.4 金属离子和部分有机化学试剂对重组中性植酸酶PPhyCm6活性的影响

3.5 重组中性植酸酶PPhyCm6底物特异性

3.6 氟化钠和钒酸铵对重组中性植酸酶PPhyCm6活性的影响

4 讨论

小结

第三章主要结论、创新点及后续研究展望

1 主要结论

2 创新点

3 后续研究展望

参考文献

附录

个人简历和主要发表及录用的论文

中性植酸酶产生菌的筛选及基因工程菌的构建

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢