家蚕感觉神经元膜蛋白基因BmSNMP的多角体融合表达、纯化与表达分析

论文摘要

昆虫在处理来自环境的化学信号过程中,嗅觉起着非常重要的作用,其对昆虫的栖息地的选择、觅食、信息传递以及寻找配偶、产卵场所、寄主和猎物等行为都具有重要的作用。感觉神经元膜蛋白（sensory neuron membrane protein, SNMP）是参与昆虫气味识别的重要蛋白之一,在人类基因中属于CD36基因家族成员,是CD36家族中唯一在神经元中发现的基因。家蚕特别是其成虫的嗅觉是研究昆虫化学通讯的理想模型,一直备受关注。我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条序列。生物信息学分析发现此序列含一个1569 bp的开放阅读框（open reading frame, ORF）,编码一个由522个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为56.76 kD,等电点为8.58。由于其所编码的蛋白含有一个完整的CD36保守结构域,且与其他物种中的SNMP蛋白有很高的同源性,故将该基因命名为BmSNMP。GenBank登录号：NM 001043721。通过PCR扩增获得的BmSNMP基因,构建原核表达载体pET-32a（+）-polh-tev-BmSNMP,将构建的重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态细胞,经IPTG诱导,高效表达重组融合蛋白。利用多角体蛋白的性质通过pH值的调节和离心及阴离子交换层析纯化蛋白Polh-tev-BmSNMP,纯化的蛋白用TEV酶切。构建转座载体pFastBac HTb-polh-BmSNMP,将polh-BmSNMP基因转座到杆状病毒基因组（Bacmid）上,构建Bacmid-polh-BmSNMP,通过脂质体将Bacmid-polh-BmSNMP转染家蚕BmN细胞获得重组病毒vBmpolh-BmSNMP。重组病毒感染正常家蚕细胞,Western blotting鉴定结果显示多角体融合的BmSNMP蛋白在家蚕细胞中获得成功表达。同理构建重组病毒vBmpolh-BmSNMP-EGFP,感染家蚕细胞后荧光显微镜下观察细胞体内的荧光,发现绿色荧光都在细胞膜附近,表明BmSNMP在真核细胞中表达且为膜蛋白。利用荧光定量PCR技术对BmSNMP基因在家蚕五龄幼虫各组织中的转录情况进行分析。荧光定量PCR结果显示,在五龄幼虫不同组织中BmSNMP基因的转录差异较大,从高到低依次为脂肪体、气门、丝腺、马氏管、中肠、性腺、头部和表皮。上述研究将为进一步研究BmSNMP蛋白的功能打下基础。此外,体外转录dsRNA,脂质体法转染BmN细胞,以MTT法检测干扰前后细胞活力,RNA干扰后的细胞活力上升；将细胞用PI染色后流式细胞仪分析,与对照组相比,干扰后S期细胞数量减少,说明polh融合的BmSNMP基因影响细胞周期,可能与细胞周期的调控有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 膜蛋白的研究
• 2 昆虫杆状病毒表达载体系统
• 2.1 杆状病毒
• 2.2 昆虫杆状病毒表达系统
• 2.3 家蚕/BmNPV表达系统相对于Sf细胞/AcMNPV表达系统的优势
• 2.4 大肠杆菌-昆虫细胞穿梭载体系统（Bac-to-Bac）
• 3 多角体蛋白
• 4 感觉神经元膜蛋白
• 第二章 实验设计方案
• 1 实验目的、意义
• 2 实验内容
• 3 实验流程图
• 第三章 生物信息学分析
• 1 序列与工具
• 1.1 序列
• 1.2 工具
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 BmSNMP基因的序列分析
• 3.2 BmSNMP蛋白的疏水性分析
• 3.3 BmSNMP蛋白的跨膜分析
• 3.4 BmSNMP蛋白的信号肽分析
• 3.5 BmSNMP蛋白的亚细胞定位分析
• 3.6 BmSNMP蛋白的二级结构预测
• 3.7 BmSNMP蛋白的三级结构预测
• 3.8 氨基酸序列同源性分析
• 4 讨论
• 第四章 家蚕BmSNMP基因融合polh基因的表达载体构建
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌种
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配置
• 2 方法
• 2.1 家蚕组织总RNA的提取和cDNA的合成
• 2.1.1 组织RNA的提取
• 2.1.2 cDNA第一链的合成
• 2.2 BmSNMP基因的PCR扩增
• 2.3 重组质粒pBacPAK8-polh-tev-BmSNMP的构建
• 2.3.1 纯化回收的目的基因BmSNMP和pBacPAK8-polh-tev的双酶切
• 2.3.2 连接反应
• 2法制备E.coli TG1、BL21（DE3）感受态细胞'>2.4 用CaCl₂法制备E.coli TG1、BL21（DE3）感受态细胞
• 2.5 连接产物的转化
• 2.6 重组质粒的筛选和鉴定
• 2.6.1 提取重组质粒
• 2.6.2 重组质粒的PCR及双酶切鉴定
• 2.6.3 重组质粒的测序鉴定
• 2.7 构建重组载体pET-32a（+）-polh-tev-BmSNMP
• 2.7.1 重组载体pBacPAK8-polh-tev-BmSNMP和pET-32a（+）的双酶切
• 2.7.2 连接反应
• 2.7.3 连接产物的转化
• 2.7.4 重组克隆的筛选和鉴定
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增目的片段
• 3.2 重组质粒pBacPAK8-polh-tev-BmSNMP鉴定
• 3.3 序列测定
• 3.4 目的片段polh-tev-BmSNMP双酶切回收
• 3.5 重组载体pET-32a（+）-polh-tev-BmSNMP鉴定
• 4 讨论
• 第五章 重组蛋白的表达和纯化
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2 通过pH值调节和离心分离纯化蛋白Polh-tev-BmSNMP
• 2.3 Western blotting鉴定蛋白表达
• 2.4 Polh-tev-BmSNMP蛋白的TEV酶消化
• 3 结果
• 3.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.2 调节pH值粗纯化融合蛋白Polh-BmSNMP
• 3.3 阴离子交换层析及Western blotting鉴定纯化条带
• 3.4 纯化融合蛋白的TEV酶酶切
• 4 讨论
• 第六章 家蚕BmSNMP基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 重组载体pFastBac HTb-polh-tev-BmSNMP的构建
• 2.3 产物连接及转化
• 2.4 重组基因组Bacmid-polh-BmSNMP的构建
• 2.4.1 DH10Bac菌感受态的制备
• 2.4.2 重组质粒的转化
• 2.4.3 重组Bacmid的提取
• 2.4.4 重组Bacmid PCR鉴定
• 2.5 细胞培养与冻存、复苏
• 2.5.1 家蚕细胞BmN贴壁培养
• 2.5.2 细胞冻存
• 2.5.3 细胞复苏
• 2.6 重组病毒vBmpolh-BmSNMP的构建及鉴定
• 2.6.1 重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞
• 2.6.2 重组病毒vBmpolh-BmSNMP鉴定
• 2.7 目的蛋白Polh-BmSNMP在家蚕BmN细胞中的表达
• 2.8 Western blotting鉴定蛋白表达
• 2.9 MTT检测细胞活力
• 2.10 流式细胞仪检测
• 2.11 重组载体pFastBac HTb-polh-BmSNMP-EGFP的构建
• 2.11.1 EGFP基因的PCR扩增
• 2.11.2 纯化回收的EGFP和重组质粒pFastBac HTb-polh-BmSNMP的双酶切
• 2.12 重组病毒vBmpolh-BmSNMP-EGFP的构建及荧光观察
• 3 结果
• 3.1 重组质粒pFastBac HTb-polh-BmSNMP的筛选和鉴定
• 3.2 重组Bacmid PCR鉴定
• 3.3 重组病毒vBmpolh-BmSNMP的PCR鉴定
• 3.4 Polh-BmSNMP蛋白在家蚕细胞中表达的Western blotting鉴定
• 3.5 MTT检测结果分析
• 3.6 流式细胞仪检测
• 3.7 PCR扩增基因片段EGFP
• 3.8 重组载体pFastBac HTb-polh-BmSNMP-EGFP鉴定
• 3.9 荧光显微镜下观察细胞内的荧光
• 4 讨论
• 第七章 BmSNMP基因的转录水平分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂及仪器
• 2 方法
• 2.1 家蚕组织总RNA的提取和cDNA的合成
• 2.2 荧光定量PCR引物的设计
• 2.3 荧光定量PCR
• 2.4 荧光定量PCR数据分析
• 3 结果
• 3.1 家蚕五龄幼虫各组织中BmSNMP mRNA量的变化
• 4 讨论
• 第八章 RNA干扰试验
• 1 试剂和材料
• 1.1 材料与设备
• 1.2 试剂
• 2 方法
• 2.1 dsRNA的合成
• 2.1.1 合成体外转录模板
• 2.1.2 体外转录RNA
• 2.1.3 dsRNA浓度的测定
• 2.2 RNAi----dsRNA的转染
• 2.3 MTT检测细胞活力
• 2.4 流式细胞仪检测
• 3 结果
• 3.1 dsRNA的合成
• 3.2 BmSNMP RNAi的MTT检测结果分析
• 3.3 流式细胞仪检测
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢