抗河豚毒素抗体的制备及鉴定

论文摘要

河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）是一种小分子量海洋神经毒素,主要存在于河豚鱼体内,特别是在卵巢和肝脏中。虽然河豚鱼味道鲜美,但是TTX是毒性极强,它能够与细胞膜表面的Na+通道受体结合,阻碍神经和肌肉的传导,从而导致神经麻痹、呼吸衰竭,甚至引起死亡。在国内外的沿海地区,由于食用河豚鱼而引起中毒的事例也频繁发生,因此对TTX的定量分析的研究非常重要。目前,对TTX检测的传统方法和各种仪器分析法,由于检测时间长、灵敏度差或是样品处理复杂、成本高等原因,而限制了它们的应用和推广。本研究以建立一种快速有效的检测方法为·目的,制备高亲和力、高特异性的TTX单克隆抗体。本实验以钥孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）与TTX的偶联产物分别作为制备抗体的免疫抗原和检测抗原。通过动物免疫,获得高效价的TTX抗血清,最敏感的小鼠效价达到1：32000。通过优化基于TTX多克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法的条件,确定ELISA最佳工作条件为：包被原TTX-BSA最佳工作浓度为0.25μg/mL;抗血清最佳稀释度为1：32000；酶标二抗（HRP-IgG）的最佳稀释度1：10000。以优化条件建立ELISA标准曲线的检测线性范围为83～1906 ng/mL,最低检出限为82.15 ng/mL。批间和批内变异系数均小于9%,样品回收率为83.034%～100.296%。通过细胞融合与首创的快速筛选方法,大大缩短细胞克隆化时间,获得5株稳定分泌的单克隆细胞株,分别命名为1D3、2E12、5B9、5E5和6F9,其中1D3亚型为IgG3,其他的都属于IgG1。5B9单克隆细胞株经过扩大培养,体内诱生腹水。采用辛酸-硫酸铵法纯化获得较纯的IgG抗体,其蛋白浓度为4.66 mg/ mL,效价为1：16000,亲和力为2.55×109L/mol,属于高亲和力抗体。本研究获得的单克隆抗体为TTX的快速检测方法奠定了基础,可用于制备基于单克隆抗体的ELISA检查试剂盒、胶体金快速检测试剂条和免疫传感器法等。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写表
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1.1 TTX的起源及分布
• 1.1.1 内因起源假说
• 1.1.2 外因起源假说
• 1.2 TTX的结构性质及其衍生物
• 1.3 TTX的中毒及治疗
• 1.3.1 TTX的毒理作用
• 1.3.2 TTX中毒的治疗
• 1.4 TTX的药用价值
• 1.5 TTX的检测方法
• 1.6 研究意义及展望
• 第二章 TTX多抗血清的制备与检测
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 主要仪器设备
• 2.1.1.2 主要试剂与动物
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 动物免疫
• 2.1.2.2 抗血清的采集
• 2.1.2.3 间接酶联免疫吸附（iELISA）
• 2.1.2.4 最佳HRP-IgG酶标二抗的确定
• 2.1.2.5 包被原与抗血清的确定
• 2.1.2.6 最佳封闭液的选择
• 2.1.2.7 一抗稀释液的选择
• 2.1.2.8 绘制竞争标准曲线
• 2.1.2.9 样品TTX的提取
• 2.1.2.10 加标样品回收率和变异系数的测定
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 免疫抗原的制备
• 2.2.2 血清效价的检测
• 2.2.3 最佳HRP-IgG酶标二抗的确定
• 2.2.4 最佳包被抗原与抗血清的确定
• 2.2.5 最佳封闭液的选择
• 2.2.6 一抗稀释液的选择
• 2.2.7 标准曲线的绘制
• 2.2.8 加标样品的检测
• 2.3 讨论
• 2.3.1 动物的选择
• 2.3.2 关于免疫
• 2.3.3 关于封闭与洗涤
• 2.3.4 关于TTX的ELISA检测方法
• 2.3.5 关于标准曲线的拟合
• 第三章 TTX单克隆抗体的制备与鉴定
• 引言
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 主要仪器设备
• 3.1.1.2 主要试剂与动物
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 细胞的复苏
• 3.1.2.2 细胞冻存
• 3.1.2.3 饲养细胞的制备
• 3.1.2.4 骨髓瘤细胞的制备
• 3.1.2.5 脾细胞的制备
• 3.1.2.6 细胞融合
• 3.1.2.7 细胞克隆化
• 3.1.2.8 细胞染色体分析
• 3.1.2.9 McAb亚类的鉴定
• 3.1.2.10 抗体亲和力的测定
• 3.1.2.11 小鼠体内诱生抗体
• 3.1.2.12 抗体的纯化
• 3.1.2.13 SDS-PAGE检测抗体
• 3.1.2.14 蛋白浓度的测定
• 3.1.2.15 抗体特异性的测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 细胞融合与筛选
• 3.2.2 细胞染色体分析
• 3.2.3 McAb亚类的鉴定
• 3.2.4 抗体的纯化结果
• 3.2.5 抗体特异性的测定
• 3.2.6 抗体亲和力的测定
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于细胞的融合与筛选
• 3.3.2 关于细胞亚克隆
• 3.3.3 关于体内诱生腹水型抗体
• 3.3.4 关于McAb的纯化
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 附录1 培养基的配制
• 附录2 ELISA试剂的配制
• 附录3 SDS-PAGE凝胶电泳试剂的配制
• 附录4 SDS-PAGE凝胶电泳分离胶与浓缩胶的配制
• 附录5 透析袋的处理
• 致谢