马体细胞核移植的研究

马体细胞核移植的研究

论文摘要

体细胞核移植技术为家畜快速繁育和基因组保存提供了新的机遇和方法。在我国,这项技术在牛羊等家畜的繁育上已得到应用,但在马的繁殖上还很少开展这方面的研究。本研究以纯血马的体细胞为供核细胞,分别以马和驴的卵母细胞为胞质受体构建同种和异种体细胞核移植胚,建立了马的体细胞培养体系及马和驴卵母细胞的体外成熟培养体系,并对胚胎的体外培养、手术法移植早期异构克隆胚到受体马输卵管进行了相关的研究。1.马体细胞系的建立本研究通过对马腿部皮肤组织的体外培养、冻存和复苏的实验研究,建立了马成纤维细胞的培养和保存体系。2.马体细胞核移植胚的构建通过对马卵母细胞两种采集方法的对比,发现切割法比抽吸法更适合马卵母细胞的收集,可获得较高的回收效率。以M199和DMEM/F12为基础培养液用于马卵母细胞的体外成熟培养,结果显示成熟率差异不显著。扩展型(Ex) COCs体外培养24-28小时和紧凑型(Cp) COCs体外培养30-36小时后成熟率分别达到65.2%和42.9%,两种类型COCs成熟后的MⅡ期卵母细胞且具有相同的发育能力。马体细胞核移植实验中发现140V,20Us, 2次脉冲的条件可获得较高的融合效率,融合率达72.5%。采用Ionomycin与6-DMAP和CHX联合激活,重构配的卵裂率为41.9%。3.马-驴异种核移植胚的构建本实验分别采用M199培养液,DMEM/F12培养液和由M199培养液与DMEM/F12培养液按1:1混合组成的培养液作为驴卵母细胞的体外成熟基础培养液,最终成熟率差异不显著(p>0.05),并且这三种成熟液驴卵母细胞的孤雌激活和发育无显著影响。提高成熟液中钙离子的浓度不能有效提高驴卵母细胞体外成熟和孤雌激活的效率。驴的COCs同马的COCs相似也分为扩展型(Ex) COCs和紧凑型(Cp) COCs,两种类型的COCs分别成熟培养30-36小时和24-28小时后获得MⅡ期卵母细胞的效率分别为75.9%和55.2%。驴卵母细胞在室温下放置于EH培养液中12小时内对卵母细胞的体外成熟率无显著影响。长时间(20-22小时)的运输卵巢、卵母细胞或是使用简易便携式培养系统在运输途中成熟培养驴卵母细胞都不利于卵母细胞的成熟,但后两种方法的成熟效率高于前一种方法。SOFaa和DMEM/F12都可用于驴的胚胎体外培养,差异不显著(p>0.05)。提高发育液中葡萄糖的浓度可促进胚胎的发育,但差异不显著。以马皮肤成纤维细胞和去核的驴卵母细胞胞质体构建马-驴异种核移植胚胎,在融合参数为130-150V,20Us,2次脉冲时可获得较高的融合率,融合率为60-70%,采用Ionomycin与6-DMAP和CHX联合激活,重构配的卵裂率为48.4%。共移植了46枚早期马-驴异种核移植胚胎到5匹受体马的输卵管中,90天检测均未建立妊娠。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1. 引言
  • 1.1 哺乳动物体细胞核移植研究进展
  • 1.1.1 哺乳动物体细胞克隆技术的研究现状
  • 1.1.2 哺乳动物体细胞克隆技术的步骤
  • 1.1.3 目前诞生的几种克隆哺乳类动物及克隆技术在应用中遇到的问题
  • 1.1.4 体细胞克隆技术与其他技术的结合应用
  • 1.1.5 体细胞克隆技术存在的问题
  • 1.2 哺乳动物异种核移植研究进展
  • 1.2.1 哺乳动物异种核移植的研究现状
  • 1.2.2 影响哺乳动物异种核移植效率的因素
  • 1.2.3 异种细胞核移植技术的应用前景
  • 1.2.4 马异种核移植研究
  • 1.3 马体细胞克隆研究进展
  • 1.3.1 马卵母细胞体外成熟
  • 1.3.2 马克隆胚的构建
  • 1.3.3 克隆马的效率
  • 1.4 本研究的目的意义及研究内容
  • 1.4.1 研究的目的和意义
  • 1.4.2 研究内容
  • 2 马皮肤成纤维细胞的分离和体外培养的研究
  • 2.1 实验材料和方法
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 实验试剂
  • 2.1.3 实验仪器
  • 2.1.4 操作液
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 马皮肤组织的采集
  • 2.2.2 原代培养
  • 2.2.3 传代培养和纯化
  • 2.2.4 细胞冷冻保存
  • 2.2.5 细胞解冻复苏
  • 2.2.6 细胞生长曲线
  • 2.2.7 染色体检查
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 细胞的培养
  • 2.3.2 细胞的生长曲线
  • 2.3.3 染色体计数分析
  • 2.4 讨论
  • 2.5 小结
  • 3 马体细胞核移植的研究
  • 3.1 实验材料和方法
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.2 实验试剂
  • 3.1.3 实验仪器
  • 3.1.4 操作液
  • 3.1.5 卵母细胞体外成熟液
  • 3.1.6 孤雌激活液
  • 3.1.7 胚胎培养液
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 马卵母细胞体外成熟和孤雌激活
  • 3.2.2 马的体细胞克隆胚的构建
  • 3.3 数据分析
  • 3.4 结果
  • 3.4.1 不同采卵方法对卵母细胞回首率的影响
  • 3.4.2 不同成熟液对卵母细胞体外成熟的影响
  • 3.4.3 不同成熟液对卵母细胞孤雌激活效率的影响
  • 3.4.4 不同类型卵母细胞对卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率的影响
  • 3.4.5 核移植效率
  • 3.4.6 融合电压对融合效率的影响
  • 3.4.7 克隆胚发育情况
  • 3.5 讨论
  • 3.6 小结
  • 4 马体细胞-驴卵母细胞异种核移植研究
  • 4.1 实验材料和方法
  • 4.1.1 实验材料
  • 4.1.2 实验试剂
  • 4.1.3 实验仪器
  • 4.1.4 操作液
  • 4.1.5 卵母细胞成熟液
  • 4.1.6 孤雌激活液
  • 4.1.7 胚胎培养液
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 驴卵巢的收集和驴卵母细胞的采集
  • 4.2.2 驴卵母细胞的体外成熟
  • 4.2.3 驴卵母细胞孤雌激活和体外发育
  • 4.2.4 马-驴异种克隆胚的构建
  • 4.3 数据分析
  • 4.4 结果
  • 4.4.1 不同成熟液对驴卵母细胞体外成熟的影响
  • 4.4.2 不同成熟液对孤雌胚发育的影响
  • 4.4.3 不同卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟的影响
  • 4.4.4 不同卵母细胞保存对驴卵母细胞体外成熟的影响
  • 4.4.5 不同运输方式对卵母细胞体外成熟的影响
  • 4.4.6 不同激活方法对驴卵母细胞激活效率的影响
  • 4.4.7 不同发育液对驴卵母细胞孤雌胚胎发育的影响
  • 4.4.8 提高发育液中葡萄糖浓度对驴孤雌胚胎发育的影响
  • 2+ 浓度对驴卵母细胞成熟和激活效率的影响'>4.4.9 提高成熟液 Ca2+浓度对驴卵母细胞成熟和激活效率的影响
  • 4.4.10 不同融合电压对马-驴克隆胚融合效率的影响
  • 4.4.11 融合胚激活和发育情况
  • 4.4.12 胚胎移植结果
  • 4.5 讨论
  • 4.5.1 不同成熟液对卵母细胞体外成熟的影响
  • 4.5.2 不同成熟液对孤雌发育的影响
  • 4.5.3 不同卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟的影响
  • 4.5.4 不同卵母细胞保存时间对卵母细胞体外成熟的影响
  • 4.5.5 不同运输方式对驴卵母细胞体外成熟的影响
  • 4.5.6 不同激活方法对驴卵母细胞激活效率的影响
  • 4.5.7 不同发育液对驴卵母细胞的孤雌胚胎发育的的影响
  • 4.5.8 提高发育液中葡萄糖浓度对驴的孤雌胚胎发育的影响
  • 2+ 浓度对驴卵母细胞成熟和激活效率的影响'>4.5.9 提高成熟液 Ca2+浓度对驴卵母细胞成熟和激活效率的影响
  • 4.6 小结
  • 致谢
  • 参考文献
  • 作者简介
  • 相关论文文献

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    • [3].人卵母细胞冷冻研究进展[J]. 医学综述 2019(24)
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    • [5].玻璃化冷冻对哺乳动物MⅡ期卵母细胞表观遗传学的影响[J]. 中国畜牧兽医 2020(09)
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    • [7].羊卵母细胞核成熟抑制剂及其作用效果的研究进展[J]. 中国草食动物科学 2012(S1)
    • [8].3种药物对老化卵母细胞4种母源mRNA水平的影响[J]. 动物学杂志 2010(05)
    • [9].动物卵母细胞透明带与受精的关系[J]. 井冈山学院学报 2008(04)
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    • [11].C型钠钛对犬卵母细胞体外成熟效果的影响[J]. 中国畜牧杂志 2020(06)
    • [12].卵母细胞激活障碍的原因与对策[J]. 国际生殖健康/计划生育杂志 2018(03)
    • [13].卵母细胞第一极体形态对受精结局的影响[J]. 广东医学 2016(24)
    • [14].人类卵母细胞冷冻现状的研究进展[J]. 实用医技杂志 2014(03)
    • [15].卵母细胞慢速冻融技术临床应用分析[J]. 湘南学院学报(医学版) 2014(02)
    • [16].玻璃化冷冻人卵母细胞的临床应用:附一例成功分娩[J]. 生殖医学杂志 2009(02)
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    • [18].电脉冲对不同卵龄的MⅡ期卵母细胞激活影响[J]. 齐齐哈尔医学院学报 2009(18)
    • [19].卵母细胞激活[J]. 生命的化学 2008(02)
    • [20].西藏林芝牦牛卵母细胞体外成熟培养[J]. 高原农业 2018(01)
    • [21].无原核有双极体的卵母细胞体外发育潜能及移植结局的探讨[J]. 中国性科学 2017(04)
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    • [23].哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展[J]. 黑龙江动物繁殖 2010(06)
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    • [27].34个周期玻璃化冷冻卵母细胞临床应用分析[J]. 实用妇产科杂志 2014(10)
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    • [30].人卵母细胞玻璃化冷冻的分子表达变化[J]. 国际生殖健康/计划生育杂志 2019(05)

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