转化生长因子β不敏感的树突状细胞疫苗对小鼠肺转移肾癌的免疫治疗作用研究

论文摘要

目的:树突状细胞（DC）是一种最强的抗原递呈细胞,目前在肿瘤疫苗中已被广泛应用。但是它们抑制肿瘤的能力经常被肿瘤分泌的免疫抑制因子所抑制,如转化生长因子β（TGF-β）。在本研究中,我们应用TGF-β不敏感的DC疫苗免疫荷瘤小鼠来评论其对肺转移肾癌的治疗效果。我们应用包含显性负相II型TGF-β受体（TβRIIDN）基因的逆转录病毒来感染肿瘤裂解物冲击过的DC细胞。TβRIIDN能够阻断TGF-β向Smad-2的信号转导,导致核内下游基因的转录被切断。应用TβRIIDN DC免疫Renca肺转移癌的小鼠可以诱导强大的针对Renca的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应,抑制肺转移,延长小鼠生存期。这些结果显示阻断DC的TGF-β信号通路可以增强DC疫苗抗肿瘤的效率。方法:1)构建含有显性负相TGF-βII型受体（TβRIIDN）质粒的逆转录病毒:含有TβRIIDN质粒的逆转录病毒转染293包装细胞,32℃下共转染12小时,10% DMEM培养基37℃下孵化过夜,PBS漂洗后同样条件再次转染293细胞24小时,收集上清,获得含有TβRIIDN重组逆转录病毒。2)负载小鼠肾癌Renca抗原的DC细胞分离、培养及鉴定:将Balb/c小鼠新鲜骨髓用红细胞去除法获取DC细胞,加入含rhIL-4（1000U/ml）、GM-CSF（1000U/ml）的完全培养基,隔日半量换液,在第6d梯度离心收获非粘附细胞为非成熟的DC细胞。反复冻融获得Renca细胞裂解物,裂解物反复刺激冲击非成熟的DC细胞获得负载肾癌抗原的成熟DC细胞（TP-DC）。于光镜下形态学鉴定,用流式细胞仪检测细胞表型MHC classII,CD40,CD11c,CD80和CD86。3)DC细胞转染,获取TGF-β不敏感TP-DC细胞（TGF-βinsensitiveTP-DC）:含有TβRIIDN及GFP基因及单纯GFP基因重组逆转录病毒转染负载Renca抗原的TP-DC细胞5%CO2、37℃下孵化48小时,获得表达TGF-βinsensitive TP-DC细胞,及GFP TP-DC细胞,流式细胞仪检测DC细胞表型变化。4)TβRIIDN-DC细胞体外实验:不同的DC细胞与TGF-β共同培养,脱氧胸腺嘧啶苷核素掺入法进行增殖抑制实验,Western blot检测Smad-2和磷酸化Smad-2的表达。5)DC疫苗体内抗肿瘤评价:建立肾癌Renca肺转移小鼠模型Balb/c小鼠40只,随机分为4组,每组10只,分别尾静脉注射Renca细胞5×105个。于注射后第7天分别皮下注射TGF-βinsensitive TP-DC细胞、GFPTP-DC细胞、TP-DC细胞和新分离培养成熟的DC（na?ve DC）第10天重复注射一次,观察至第60天各组荷瘤小鼠的生存情况和肺重量的改变。6)体外CTL活性及细胞因子检测:取另一组同法建立的免疫后小鼠模型,最后一次疫苗免疫后10d取其脾脏,分离活化T淋巴细胞,51Cr释放实验测定肿瘤特异性杀伤T细胞（CTL）对Renca细胞的细胞毒作用。小鼠乳腺癌EMT-6作为对照靶细胞。取小鼠血清行酶联免疫吸附（ELISA）测定细胞因子IFN-γ和IL-2变化情况。结果:1)流式细胞仪分析:小鼠骨髓来源的DC细胞纯度为84.88%。对GFP荧光分析提示TβRIIDN和GFP的逆转录病毒转染效率分别为92.13%和91.95%。对标志成熟的表明分子MHCclass II,CD40,CD80和CD86的分析提示3种TP-DC明显高于na?ve DC（p<0.05）,但3种TP-DC之间并无明显差异（p>0.05）。2)Smad2磷酸化的检测:western-blot显示Smad2在4组DC中均存在,但是当应用TGF-β孵育后,磷酸化的Smad2（P-Smad2）只在GFPTP-DC,TP-DC,和na?veDC中存在,在TGF-βinsensitive TP-DC并没有见到P-Smad2。说明TGF-β的信号转导被TβRII显性负相表达所阻断。3)与TGF-β共同培养24h后,TP-DC,GFPTP-DC和TGF-βinsensitiveTP-DCT的脱氧胸腺嘧啶苷核素摄入抑制率分别为61.7±4.2%,62.3±3.5%和14.3±1.4%,TGF-βinsensitive TP-DC的脱氧胸腺嘧啶苷核素摄入抑制率与其他各组比较差异有显著统计学意义（P<0.001）。4)在成功构建的Renca肺转移的小鼠模型上分别接种4种DC疫苗,TP-DC组肺重量及生存期均较na?ve DC组有明显差异（p<0.001）。TGF-βinsensitiveTP-DC组较其他两组TP-DC也有明显差异（p<0.05）。这些结果说明TGF-β不敏感的DC细胞能有效提高Renca肺转移小鼠的生存率降低肺转移率。5)51Cr释放实验测定显示3组TP-DC组CTL杀伤活性均较na?ve DC组强。但是最强的杀伤活性出现在TGF-βinsensitive TP-DC组,在E:T为100:1时,杀伤活性为76.4%。所有DC组CTL对小鼠乳腺癌细胞EMT-6无明显杀伤作用。结果表明阻断的TGF-β信号通路能增加肿瘤特异性杀伤活性,提高DC疫苗的效能。6)接种na?veDC的荷瘤小鼠体内测出IFN-γ和IL-2基础水平,接种各种TP-DC的荷瘤小鼠体内IFN-γ和IL-2水平明显升高,接种TGF-βinsensitiveTP-DC的荷瘤小鼠体内该两种细胞因子水平升高更明显。结论:1)成功构建了含有TβRIIDN质粒的逆转录病毒;2)采用小鼠肾癌细胞系Renca细胞裂解产物作为抗原加载Balb/c小鼠骨髓DC,诱导出了肾癌的DC;3)使用修饰后TβRII基因转染肾癌特异性的DC,使TβRII显性负相表达,阻断TGF-β信号通路;4)TβRIIDN并不影响转染DC细胞的表型;5)TGF-β不敏感的DC细胞能明显提高Renca肺转移小鼠的生存率,明显抑制肿瘤生长。6)TGF-β不敏感的DC细胞诱导出最强的CTL杀伤活性,E/T比率为100:1时杀伤活性为76.4%,CTL具有肿瘤特异性,对无关的小鼠乳腺癌EMT-6细胞没有杀伤作用。7)TGF-β不敏感的DC细胞处理的荷瘤小鼠体内IFN-γ和IL-2水平明显升高。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾 TGF-β与DC 疫苗在肿瘤治疗中的应用
• 正文
• 第一部分 小鼠肾癌Renca 特异性DC的分离、培养及鉴定
• 1 引言
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 第二部分 TGF-β不敏感的小鼠肾癌特异性DC 疫苗的体外构建及鉴定
• 1 引言
• 2 试验材料
• 3 试验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 第三部分 TβRIIDN TP-DC 疫苗的肺转移 肾癌动物模型实验
• 1 引言
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢