产植酸酶木霉菌的遗传基因改良

论文摘要

植酸酶（myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases）,是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称。植酸酶主要存在于植物、微生物和一些动物组织中。单胃动物如猪、鱼和家禽类不能消化植酸,饲料中加入植酸酶分解植酸,促进单胃动物对磷和金属元素的吸收和利用,另外还可以降低环境中的磷污染。本文以木霉为研究对象,以各地采集木霉为基础筛选高产植酸酶菌株。通过植酸钙透明圈筛选法,再经过植酸酶液体发酵酶活最终选择11号菌株为出发菌株进行基因组改组（Genome shuffling）技术。11号菌株通过紫外诱变和亚硝基胍诱变,筛选优良诱变子,将两种诱变子的原生质体分别进行热灭活和紫外灭活,然后随机融合,筛选融合子。紫外诱变和亚硝基胍诱变均以出发菌株为诱变菌株,选着合适的剂量进行诱变改良。从大量的诱变子中通过初筛和复筛筛选出合适的诱变子。紫外诱变子Ⅱ的酶活为最高,且5代后培养未发生回复突变,酶活为1.21±0.013 U/L,将此菌株编号为UV-Ⅱ（p<0.05）。亚硝基胍诱变中NTG-4酶活为0.94±0.014 U/L（p<0.05）。对木霉的原生质体制备和再生条件进行了研究。分别考察了菌体菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度等因素对木霉原生质制备和再生的影响。霉菌细胞壁主要成分是多糖,大多数是几丁质、少数种类是纤维素。以UV-Ⅱ出发菌株,以蜗牛酶为溶菌酶制备木霉原生质体。研究得到木霉原生质体制备条件:蜗牛酶浓度2.0mg/mL,菌龄为20h,酶解时间2.0 h,酶解温度30℃。基因组改组技术将UV-Ⅱ和NTG-4的原生质体分别进行热灭活和紫外灭活,然后随机结合,使用PEG为融合剂进行原生质体融合。两两结合进行4轮基因组改组,筛选到融合子Fu-②,酶活为2.4±0.016 U/L,比原始菌株分别高出320%。融合子遗传特性稳定。对融合子Fu-②进行液体培养基优化实验,得到优化培养基Ⅱ培养基:葡萄糖3.0 g ,可溶性淀粉3.0 g,麸皮0.05 g,NH4NO30.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,MnSO4·7H2O 0.003 g,FeSO4·7H2O 0.003 g,CaCO3 0.5 g,pH值5.5-6.0,115℃30min灭菌。同时对融合子Fu-②进行液体发酵条件优化:转速115r/min,装液量100 ml（500mL三角瓶）,接种量为3%,温度30℃,发酵时间120h,酶活3.68 U /L,酶活提高33.3%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 木霉
• 1.1.1 木霉形态
• 1.1.2 木霉在农业中的应用
• 1.2 植酸简介
• 1.3 植酸酶
• 1.3.1 植酸酶的分类
• 1.3.2 植酸酶的理化性质
• 1.3.3 植酸酶的应用
• 1.4 基因组改组技术
• 1.5 本研究的内容和目的
• 第2章 产植酸酶木霉菌种的初筛和紫外诱变
• 2.1 实验材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果和讨论
• 2.2.1 植酸钙平板透明圈初筛
• 2.2.2 木霉紫外诱变
• 2.3 本章小结
• 第3章 亚硝基胍诱变
• 3.1 实验材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果和讨论
• 3.2.1 木霉亚硝基胍诱变曲线和NTG 诱变剂量的选择
• 3.2.2 木霉亚硝基胍诱变菌株选育
• 3.3 小结
• 第4章 木霉原生质体的制备
• 4.1 实验材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要仪器和设备
• 4.1.3 主要试剂和溶液配制
• 4.1.4 主要培养基
• 4.1.5 原生质体的制备
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 木霉原生质体的制备
• 4.2.2 木霉原生质体的再生
• 4.3 小结
• 第5章 基因组改组技术
• 5.1 实验材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果和讨论
• 5.2.1 原生质体灭活
• 5.2.2 原生质体融合
• 5.2.3 基因组改组
• 5.3 小结
• 第6章 发酵条件优化
• 6.1 实验材料和方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验方法
• 6.2 实验结果和讨论
• 6.2.1 液体发酵培养基筛选
• 6.2.2 接种量发酵工艺优化
• 6.3 小结
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间主要科研成果