应用载体介导的RNAi技术及蛋白质组学方法对Id1基因在H460细胞中的功能及作用通路的初步研究

论文摘要

Id（inhibitor of DNA binding and /or differentiation）家族属于 HLH 蛋白家族成员之一,具有一段高度保守的 HLH 结构域,但却缺少与 DNA 结合的碱性区。因此 Id 家族成员能够与碱性的 HLH 蛋白形成异源二聚体,令后者不能够与 DNA 结合,因此在细胞中作为主要的抑制转录的负调控因子存在（Benezra,R.,et al.,1990;Garrell,J.,et al.,1990） 。Id蛋白在多种细胞的分化与转录调控中发挥着相当复杂的作用,并且在多种肿瘤细胞中高表达。 本室曾利用半定量 RT-PCR 检测到 Id1 在肺癌细胞中表达升高,因此,为深入研究 Id1 基因在人肺癌细胞中的作用,我们利用载体介导的 RNAi 干扰技术特异性沉默人大细胞肺癌 H460细胞的 Id1 基因的表达,并通过筛选获得稳定干扰的克隆细胞株,进行各项生理生化指标的测定。并结合蛋白质组学方法,进一步分析其作用通路中可能的相关蛋白。 实验结果表明,Id1 基因被显著沉默的细胞株各项生理指标发生较为明显的变化。在培养中发现,细胞的贴壁性增强。生长曲线显示细胞增殖明显受到抑制,生长缓慢。软琼脂集落形成率实验显示 Id1 基因被沉默后,几乎不能在软琼脂上形成克隆。间接的说明了 Id1 可能具有直接致瘤作用。流式细胞光度术分析结果显示,Id1 基因被沉默后,细胞周期受到一定程度的影响,G1 期所占的比例升高,S 期缩短,这与细胞增殖受阻生长缓慢相吻合,同时提示我们 Id1 基因可能通过与细胞周期中的相关蛋白相互作用而对细胞周期进行调控。 Id1基因被沉默的细胞株中,经Western Blotting检测发现,p21和p16表达量有一定程度的增强,那么可推测在人肺癌细胞中,在Id1被沉默后,一方面可能通过p21-CDK通路阻抑细胞进入S期,另一方面可能通过上调p16,从而活化pRb/p16途径来抑制细胞的过度增殖。而其与Rb的相互作用还需要经过实验进一步验证。 在本实验中,半定量 RT-PCR 结果显示 Id1 基因 mRNA 水平明显下降,Id3,Id4 基因 mRNA水平无明显变化,而 Id2 基因的 mRNA 水平则有一定程度的上升。根据这一结果,我们推测,在人肺癌细胞中,Id1 和 Id2 蛋白间可能在功能上存在一定关联,在 Id1 基因被严重沉默的细胞中,Id1 的低表达可能作为某种信号,通过一定的作用通路促进 Id2 的表达,从而拮抗由Id1 低表达引起的细胞生理生化变化。这也提示我们在肺癌的基因治疗中,仅仅抑制 Id1 的表达可能不能够达到最佳的效果。 我们利用蛋白质组学方法鉴定了Id1基因被明显沉默的细胞中的15个差异表达蛋白的ID,其中上调蛋白 11 个,下调蛋白 4 个。其中上调蛋白包括可能与 Id 蛋白的降解通路相关的泛素 C 末端水解酶（Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1）及与转录调控相关的锌指 BED 结构域结合蛋白 1（Zinc finger BED domain containing protein 1）等。推测其可能参与 Id1 蛋白调控转录的作用通路,其相互关系仍在进一步研究中。 这些结果不仅对深入探讨 Id1 基因的在肺癌细胞中的功能及作用通路有极大的帮助,而且也对利用 RNAi 干扰技术实现肿瘤的基因治疗提供了重要的理论基础和参考价值。

论文目录

• 文献综述
• 1 细胞周期概述
• 1.1 细胞周期检验点及在细胞周期调控中的作用
• 1.2 细胞周期中主要调控因子
• 1.3 细胞周期与细胞癌变
• 2 ID 基因与细胞周期增殖调控
• 2.1 HLH 蛋白
• 2.2 Id 蛋白的结构
• 2.3 Id 蛋白与细胞分化
• 2.4 Id 蛋白和细胞周期
• 2.5 Id 蛋白和凋亡
• 2.6 Id 蛋白和肿瘤发生
• 2.7 Id 基因的作用方式和调控模型
• 3 RNAI 概述
• 3.1 RNAi 的发现
• 3.2 RNAi 的特征
• 3.3 RNAi 的分子机制
• 3.4 RNAi 技术的应用
• 3.5 展望
• 前言
• 材料方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 RNAi 体内转录表达载体的构建
• 2.2 稳定RNAi 克隆细胞株的获得
• 2.3 半定量RT-PCR 检测Id1 基因被沉默的细胞中四种Id 基因的mRNA 水平
• 2.4 细胞生长活性的测定
• 2.5 流式细胞光度术（FMC）
• 2.6 免疫荧光分析中心体的变化
• 2.7 Western Blotting 分析蛋白表达变化
• 2.8 双向电泳寻找差异表达蛋白
• 2.9 质谱分析
• 2.10 蛋白的鉴定
• 结果
• 1 稳定沉默ID基因表达的细胞克隆株的建立:
• 2 半定量RT-PCR 检测ID1,ID2,ID3,ID4 基因的MRNA 水平
• 3 RNAI细胞生长和增殖能力的变化
• 4 RNAI细胞细胞周期的变化
• 5 RNAI细胞细胞周期相关因子表达量的变化
• 6 RNAI细胞中心体的变化
• 7 应用蛋白质组学方法寻找 RNAI干扰后差异表达蛋白
• 讨 论
• 结 论
• 参考文献
• 缩略语表
• 致 谢
• 附 录