论文摘要
棉花是世界性重要的经济作物。棉纤维是世界上最重要的纺织原料之一,是由种子胚珠外表皮细胞经过一系列发育调控形成,其单细胞结构为研究相关基因在发育中的功能提供了一个良好的实验系统。阐明棉纤维发育重要基因功能对理解单细胞结构的棉纤维发育机理,进而通过分子育种手段改良棉纤维品质具有重要意义。本实验室通过筛选陆地棉优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库,获得了一个与棉纤维发育相关的编码331个氨基酸的cDNA克隆,命名为GhCFE（Gossypium hirsutum cotton fiber expressed protein, Genbank No. DQ073045）。本研究即在此基础上对GhCFE基因进行更深入的结构与功能研究。该基因编码的蛋白包含两个未知功能的结构域,分别是DUF761及其N端的DUF4408。Southern blot显示四倍体陆地棉基因组中存在2个拷贝,推测At. Dt亚基因组中各有一个拷贝,进一步从两个二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉及四倍体栽培棉种TM-1、海7124基因组中分离到GhCFE同源基因序列,结构分析显示该基因在不同棉种中的基因组序列相似,均包含2个外显子和1个内含子。通过原核表达技术,从大肠杆菌中纯化到预期大小的棉纤维表达蛋白,说明GhCFE基因可有效编码蛋白。蛋白预测显示其N端具有一个26个氨基酸残基的信号肽,通过GhCFE:GFP融合载体转化棉花原生质体后特异表达于质体中。组织、器官表达分析显示,该基因在陆地棉根、茎中几乎不表达,在叶中微弱表达,在胚珠和不同发育时期的纤维细胞中均表达,在开花后5天（5DPA）纤维中的表达量最高,开花20天后开始减弱。分析该基因在不同纤维发育突变体遗传材料中的表达特征,发现该基因在MD17, SL1-7-1, Xu142M等三个无绒无絮突变体的纤维发育早期表达均显著高于野生型TM-1同时期的表达水平。与其它发育时期相比,徐州142M在ODPA, MD17在3DPA, SL1-7-1在5DPA的表达量最高。推测GhCFE的高水平表达与棉纤维和短绒的起始发育负相关,并且也影响纤维的伸长发育。利用反向遗传学技术,研究陆地棉纤维表达蛋白基因在棉纤维发育中的功能。利用pBI121质粒载体构建了CaMV35S启动子的正义表达载体（35SC）,E6棉纤维专化表达启动子驱动的正义表达载体（E6SC）和反义表达载体（E6ASC）.以pBI121质粒空载体为对照,通过农杆菌介导的遗传转化方法将上述载体导入棉花W0品系进行转基因功能验证,分别获得上述三类载体转化的三种类型转基因棉花植株。对每个再生单株进行NPTII和启动子-基因特异引物的PCR检测,经过连续3个世代的选择,共获得15个转基因纯合株系。Southern杂交分析表明,大多数转基因株系只含一个或两个拷贝。定量RT-PCR分析发现,4个35SC转基因株系,在转基因和受体植株0 DPA胚珠中GhCFE的表达即表现显著差异,特别是转基因材料159中该基因的表达量是受体W0的二十多倍,5DPA纤维中的表达量是W0的十倍,并在纤维伸长的过程中持续高效表达；5个E6SC转基因株系,GhCFE的表达在转基因各个纤维发育时期均比受体植株显著提高,但相应时期的表达水平没有35SC转基因株系高；6个E6ASC转基因株系,GhCFE的表达量在纤维发育各个时期与W0相比,在纤维发育的5DPA,3个转基因株系表达显著下降,而在纤维发育的10DPA,6个转基因株系表达均显著下降,说明在E6ASC的转基因株系中,该基因在纤维发育期的表达被抑制。纤维品质检测发现,与受体W0相比,三类载体转化获得的转基因棉花纯系其纤维强度和细度变化不大,但纤维长度变异明显。其中正义载体35SC 4个转基因株系的纤维长度均极显著变短；E6SC 3个转基因株系纤维长度显著变短,而反义载体E6ASC的纤维长度与受体相比没有显著差异。不同转基因株系的纤维和短绒起始扫描电镜分析显示,与受体相比,35SC转基因材料中棉纤维和短绒起始密度极显著降低。在E6SC转基因材料中,其起始密度也显著降低。而在E6ASC转基因材料中,其起始密度变化不显著。同时,在35SC转基因材料中,转基因植株茎秆绒毛密度也显著降低。为阐明GhCFE作用的分子机制,构建了该基因的诱饵载体,通过酵母双杂交技术从棉纤维发育酵母文库中筛选到与GhCFE互作的四个GhACT基因,并在酵母中进行了全长基因互作验证。GhCFE的原生质体亚细胞定位显示其分布在质体中,而GhACT的原生质体亚细胞定位显示其散布在细胞质中。利用BiFC技术在拟南芥原生质体中证实CFE与ACTIN在植物细胞质体中存在直接的相互作用。GhCFE在纤维中的过量表达产物与ACTIN互作,引起ACTIN由胞质向质体的积累,使胞质中发挥生物学功能的肌动蛋白微丝骨架变得更少、更细,网状结构迟迟不能形成,最终导致棉纤维细胞伸长受阻,纤维变短；在E6ASC转基因材料中,其肌动蛋白微丝含量及网状结构与受体对照W0相差不大,说明GhCFE基因的抑制表达不影响Actin发挥作用,棉纤维长度与受体W0相比没有显著性差异。在35SC转基因拟南芥和转基因棉花中,正向调控表皮毛发育的转录因子其表达量也普遍下降,推测GhCFE的过量表达也影响了棉纤维起始发育调控网络中"GL1-GL3/EGL3-TTG1"蛋白复合体的形成,进而抑制棉纤维的起始。其作用机理需进一步探讨。