猪链球菌2型疫苗候选株的生物学特性研究

论文摘要

猪链球菌分35种血清型,其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)流行最广,发病率最高,而且可感染人致死,是一种重要的人畜共患病病原。由SS2引起的猪链球菌病常呈散发或地方性爆发,发病率和死亡率均很高,严重危害养猪业的发展。目前,猪链球菌2型疫苗研制大多集中在基因工程疫苗上,但由于猪链球菌2型致病因子复杂,单独以一种或几种毒力因子制成的亚单位苗不能起到完全的免疫保护作用.因此,灭活疫苗仍然有着不可替代的作用。研制出一种免疫原性好,副作用小的的灭活疫苗对日益增多的猪链球菌2型引起的链球菌病的预防有着重要意义。为了筛选出生物学特性较为稳定的疫苗候选株,选取猪链球菌2型的7种主要毒力因子设计并合成引物,用PCR方法对四株猪链球菌2型分离株进行检测.将各菌株连续传代培养至20代,用API 20 Strep生化鉴定试剂条和全自动生化分析仪对同一菌株各代次之间进行比较鉴定.结果显示,除SS2 BB071118株缺乏orf2外,其他分离株均同时具有被检测的7种毒力因子,属于猪链球菌2型高致病菌株；生化试验结果表明,除了SS2 HA060821株高度稳定外,其他菌株个代次之间均存在不同程度的差异,因此最终确定SS2 HA060821为疫苗候选菌株。以斑马鱼作为猪链球菌2型感染的动物模型,对SS2 HA060821株F1代和F20代菌株进行致病性比较.斑马鱼经腹腔注射接种F1代和F20代不同稀释度菌液,统计一周内斑马鱼死亡数量.结果显示,攻毒后死亡的斑马鱼具有典型的细菌性败血症病理变化,腹腔可分离到SS2菌株.HA060821株F1代和F20代菌株对斑马鱼的LD50分别为8.9×104CFU和9.5×104CFU,统计学分析结果表明二者毒力差异不显著(P＞0.05).证明SS2 HA060821株经过20代传代培养后毒力仍然稳定,因此建立了SS2HA060821株F1代和F20代基础种子批次,作为灭活疫苗的研究对象.为评价猪链球菌2型HA060821株制备的灭活疫苗对猪的免疫保护效力,将25头猪随机分成5组,分别用HA060821 F1、F20灭活疫苗,HA9801 F1、F20灭活疫苗和PBS对猪进行免疫,并用ZY05719强毒株进行效力检验；同时设立免疫HA060821灭活疫苗的抗体监测组,用间接ELISA法检测HA060821灭活疫苗免疫猪的抗体水平。结果显示监测组在第7天抗体均呈阳性,其中一次免疫组在第28天抗体效价达高峰；二次免疫组在第42天抗体水平达到高峰,抗体效价分别为1：3200和1：6400。所有免疫组对猪的保护率均为100%,但HA9801 F1、F20免疫组攻毒后各有一头猪发病,而HA060821 F1、F20免疫组未见发病；可见HA060821灭活疫苗有很好的免疫保护效果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一篇 文献综述 猪链球菌2型研究进展
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 临床症状和病理变化
• 3.1 临床症状
• 3.2 病理变化
• 4 猪链球菌2型的毒力因子
• 4.1 荚膜多糖
• 4.2 溶菌酶释放蛋白与胞外因子
• 4.3 猪溶血素
• 4.4 谷氨酸脱氢酶
• 4.5 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
• 4.6 纤连蛋白结合蛋白
• 4.7 毒力相关序列orf2
• 4.8 其他毒力因子
• 5 致病机制
• 6 猪链球菌2型的检测方法
• 6.1 分离培养和生化反应
• 6.2 血清学鉴定
• 6.3 分子生物学检测
• 7 动物模型
• 7.1 斑马鱼模型
• 7.2 小鼠模型
• 7.3 豚鼠模型
• 7.4 仔猪模型
• 7.4.1 呼吸道接种
• 7.4.2 肌肉注射
• 7.4.3 静脉接种
• 8 疫苗研究进展
• 8.1 活疫苗
• 8.2 灭活疫苗
• 8.3 基因工程疫苗
• 参考文献
• 第二篇 实验部分
• 第一章 猪链球菌2型分离株的生化试验和毒力因子分布特征
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 猪链球菌2型疫苗候选株对斑马鱼的致病性及基础种子批的建立
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪链球菌2型分离株制备灭活疫苗对猪的免疫保护比较试验
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢