四种遗传性骨病的基因诊断与产前诊断

论文摘要

遗传性骨病是一大类临床和遗传异质性较强的骨软骨发育不良疾病,常见的临床表现包括矮身材、畸形、不成比例生长以及单个或一组骨骼发育不良,主要有软骨发育不全（ACH）、脊柱骨骺发育不良（SED）、多发性骨骺发育不全（MED）等疾病。遗传性骨病的致病基因主要包括成纤维细胞生长因子受体3 （FGFR3）、Ⅰ型胶原（COL1A1）、Ⅱ型胶原（COL2A1）等。本研究对迟发性脊柱骨骺发育不良（SEDT,MIM271600）、软骨发育不全（ACH, MIM 100800）、成骨不全（01, MIM 166200）以及先天性脊柱骨骺发育不良（SEDC, OMIM 183900）等遗传家系进行研究,在明确其临床诊断的基础上,检测致病基因,为疾病的基因诊断、产前诊断、遗传咨询以及致病机制的研究奠定基础。本研究分为三部分：第一部分报告1个涉及5代63人6例迟发性脊柱骨骺发育不良（spondyloepiphyseal dysplasia tarda, SEDT）患者的家系,临床特征主要为短躯干性侏儒和脊柱侧弯,X线表现为腰椎体前部上下缘凹陷,中后部呈驼峰状突起等。分子遗传学研究发现一个新的基因突变位点,丰富了SEDT的基因型-表型谱,并探讨基因突变致选择性剪接的可能机制。方法：针对SEDL基因编码区设计引物,PCR扩增,并进行序列分析与比对。提取外周血淋巴细胞总RNA, RT-PCR扩增转录本,克隆测序并进行序列分析与比对。结果：基因组DNA测序结果显示,家系中所有患者SEDL基因exon3均发生突变（c.61 G>T, p.Glu21stop）,所有携带者均为杂合突变,家系中其他成员及400例正常对照中均未见该突变,提示SEDL基因c.61 G>T突变是导致该SEDT家系患者发病的原因。检索基因突变数据库和已发表文献显示c.61 G>T突变是SEDL基因新的突变位点。SEDL基因cDNA测序亦发现c.61 G>T突变,证实了DNA测序结果。有趣的是,RT-PCR结果发现所有患者和携带者均存在两种转录本,较长者为正常大小的转录本,较短者缺失了112bp（c.-19-c.93 del）。生物信息学分析显示,SEDL基因c.61 G>T突变后产生3个剪接抑制子。结论：SEDL基因c.61 G>T突变是一新突变方式,详细的临床与分子遗传学研究丰富了SEDT的基因型-表型谱。SEDL基因突变结果对携带者检测、症状前诊断以及患者和携带者的产前基因诊断具有重要意义。SEDL基因c.61 G>T（p.Glu21stop）突变可能激活了潜在可变剪接调控元件,抑制了exon3的剪接,转录本跳跃exon3产生转录变异体。该基因突变致选择性剪接的分子机制及生物学效应值得进一步研究。第二部分报告了3例散发的软骨发育不全（achondroplasia, ACH）病例,临床主要表现为身材矮小不成比例,短而粗的三叉手,X线特征为腰椎椎弓根间距进行性狭窄,管状骨短。进行分子遗传学研究,为ACH的产前分子诊断奠定基础。方法：针对FGFR3基因突变位点exon10片段设计引物,PCR扩增,并进行序列分析与比对。结果：3例患者FGFR3基因均发生c.1138 G>A杂合突变,导致氨基酸发生Gly380Cys改变。其中1例已妊娠11周,等待进行产前分子诊断。结论：3例患者均由于FGFR3基因发生c.1138 G>A突变导致ACH,明确了ACH临床诊断,为产前分子诊断提供了实验依据。第三部分研究胶原基因COL1A1和COL2A1突变所致疾病的基因诊断与产前诊断。报告1例成骨不全（osteogenesis imperfecta,OI）患者,并进行Ⅰ型胶原基因突变筛查,OI临床表现为骨脆性增加,蓝巩膜,易骨折,X线表现为骨质疏松,长骨皮质菲薄,骺端膨大。另外,对1例Ⅱ型胶原COL2A1基因G504S突变致先天性脊柱骨骺发育不良（spondylepiphyseal dysplasia congenita, SEDC）患者的妻子进行产前分子诊断,避免患儿出生。SEDC临床特征为身材矮小,短颈、跛行,手部正常,X线特征为扁平椎体、脊柱侧弯、股骨头骨化缺如等。方法：针对COL1A1基因编码区设计引物,PCR扩增,并进行序列分析与比对。SEDC患者妻子于20孕周在B超引导下进行羊膜囊穿刺,抽取羊水10ml,提取羊水细胞基因组DNA。选择3个多态性STR位点,即D3S1358、D16S539和D21S11,排除母体细胞污染。在此基础上,对COL2A1基因exon23进行扩增,PCR产物进行正、反向测序。结果：OI患者COL1A1基因exon45发生c.3263 G>A （p.Gly1088Glu）杂合突变,其父母、妹妹以及250例正常对照均未见该突变,提示COL1A1基因c.3263 G>A是该OI患者的遗传基础。检索基因突变数据库和已发表文献显示c.3263 G>A突变是COL1Al基因新的突变位点。进行SEDC产前分子诊断的胎儿COL2A1基因exon23正常,未带有与父亲相同的突变,且胎儿产前分子诊断结果与B超监测结果一致。结论：OI患者COL1A1基因发生c.3263 G>A（p.Gly1088Glu）突变,导致Gly-X-Y重复序列三螺旋区的Gly被Glu替代,使三螺旋结构遭到破坏,导致OI。COL1A1基因c.3263 G>A突变是一新突变方式,详细的临床与分子遗传学研究丰富了OI的基因型-表型谱。行产前分子诊断的胎儿正常,SEDC患者妻子可以继续妊娠。对于有SEDC风险的胎儿进行产前分子诊断非常重要,可以在B超诊断前了解胎儿基因型并明确诊断。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 绪论
• 参考文献
• 第一部分 X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良的基因诊断
• 第1章 SEDT的分子遗传学研究进展
• 1.1 X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良概述
• 1.2 SEDL基因突变与SEDT
• 第2章 X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良的分子遗传学研究
• 2.1 临床资料
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 本部分结论
• 参考文献
• 第二部分 软骨发育不全的基因诊断
• 第3章 软骨发育不全的研究进展
• 3.1 软骨发育不全概述
• 3.2 FGFR3基因突变与软骨发育不全
• 第4章 软骨发育不全的基因诊断
• 4.1 临床资料
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.4 结果
• 4.5 讨论
• 本部分结论
• 参考文献
• 第三部分 Ⅰ型与Ⅱ型胶原病的基因诊断及产前诊断
• 第5章 Ⅰ型胶原基因COL1A1与成骨不全
• 5.1 胶原分子结构与胶原病
• 5.2 COL1A1基因突变与成骨不全
• 第6章 成骨不全患者COL1A1基因突变的检测
• 6.1 临床资料
• 6.2 实验材料
• 6.3 实验方法
• 6.4 结果
• 6.5 讨论
• 第7章 Ⅱ型胶原基因COL2A1与先天性脊柱骨骺发育不良
• 7.1 COL2A1基因与Ⅱ型胶原蛋白
• 7.2 COL2A1基因突变与SEDC
• 第8章 先天性脊柱骨骺发育不良的产前分子诊断
• 8.1 临床资料
• 8.2 实验材料
• 8.3 实验方法
• 8.4 结果
• 8.5 讨论
• 本部分结论
• 参考文献
• 全文小结
• 附录: 英文缩写索引
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢