论文摘要
海藻糖因具优良特性而应用前景广阔。自海藻糖酶转化法发明之后,其成本大大降低使得其商业化应用成为现实。其中海藻糖合成酶法仅需一步就可将成本低廉的麦芽糖转化为海藻糖,比双酶转化法更具优势,因而成为近十几年的研究热点。为寻找耐热且活性高的海藻糖合成酶,本论文研究比较了三种不同的海藻糖合成酶生产方法。一是进行了海藻糖合成酶产生菌的筛选,最终筛选到1株海藻糖合成酶产生菌菌株L1204,分析表明其所产海藻糖合成酶虽有一定酶活性,但活性不够高；二是从能得到的海藻糖合成酶生产菌株出发,尝试构建重组海藻糖合成酶生产菌株,如从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)购买了谷氨酸棒杆菌和耻垢杆菌进行海藻糖合成酶基因的克隆和表达研究,可能受原料、试剂、操作等诸多因素的影响,耻垢杆菌并未获得有关文献所报道的结果,而谷氨酸棒杆菌所得结果与文献报道结果吻合；三是利用现代生物信息学手段对已知基因序列进行分析研究,设计了2个基因序列,委托生物公司进行人工合成及基因工程菌构建,然后对其酶学性质进行了验证,获得了比较理想的能生产海藻糖合成酶的基因工程菌TSG2013。为下一步利用(大米)淀粉或麦芽糖浆为原料生产海藻糖的研究打下了基础。比较三种不同的海藻糖合成酶的生产方法的研究结果,可以发现海藻糖合成酶产生菌的筛选虽然工作量巨大而艰辛,但仍是获取新型海藻糖合成酶的重要途径；从已知的能产海藻糖合成酶的菌株出发进行基因克隆和表达,从理论上讲,其相对工作量大大减少且成本低廉,但在实际操作上对菌种原料、试剂和操作等各环节均需特别小心,否则难以得到预期结果；而通过有关资料选定和设计新型海藻糖合成酶基因序列,委托相关生物公司合成序列及其基因工程菌,虽然最初成本高一些,但可大大缩短研究时间,并可保证研究质量,因此,是一种最有潜力的海藻糖合成酶的生产方法。
论文目录
摘要ABSTRACT第一章 绪论1.1 海藻糖的结构及性质1.2 海藻糖的制备1.2.1 化学合成法1.2.2 微生物提取法1.2.3 微生物发酵法1.2.4 酶合成法1.2.5 基因工程法1.3 海藻糖合成酶的研究现状1.3.1 海藻糖合成酶研究概况1.3.2 海藻糖合成酶酶学性质1.3.3 海藻糖合成酶基因工程1.4 课题的研究目的及意义1.5 课题研究内容第二章 海藻糖合成酶产生菌的筛选2.1 实验材料2.1.1 样品来源2.1.2 主要试剂2.1.3 主要仪器2.1.4 相关溶液2.1.5 培养基2.2 实验方法2.2.1 菌株筛选2.2.2 酶活力测定2.2.3 酶反应产物的鉴定和分析2.2.4 菌种鉴定2.3 实验结果与分析2.3.1 菌种筛选2.3.2 菌株代谢产酶试验（初筛）2.3.3 菌株代谢产酶试验（复筛）2.3.4 酶解产物中海藻糖的定量分析2.3.5 菌种鉴定2.4 本章小结第三章 海藻糖合酶基因Tres的克隆与表达3.1 实验材料3.1.1 菌株与质粒3.1.2 酶与试剂3.1.3 主要仪器3.1.4 培养基3.1.5 主要溶液3.2 实验方法3.2.1 基因组DNA的提取3.2.2 引物的合成3.2.3 琼脂糖凝胶电泳3.2.4 从琼脂糖凝胶中回收DNA3.2.5 DNA的酶切与连接3.2.6 E.coli TOP10感受态细胞的制备3.2.7 重组子的诱导表达3.2.8 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳3.3 实验结果与分析3.3.1 Tres编码基因的克隆3.3.2 重组质粒的构建和鉴定3.3.4 重组菌的构建及其表达产物的SDS-PAGE分析3.4 小结与讨论第四章 重组基因工程菌的培养与表达4.1 实验材料4.1.1 优选的两个基因序列4.1.2 菌种4.1.3 实验仪器4.1.4 主要试剂4.1.5 培养基4.1.6 主要试剂的配制4.2 实验方法4.2.1 发酵培养4.2.2 粗酶液的制备4.2.3 海藻糖合成酶酶活的测定4.2.4 菌体生长曲线的测定4.2.5 蛋白定量4.2.6 诱导表达条件研究4.3 实验结果与分析4.3.1 重组菌的摇瓶生长曲线4.3.2 重组菌的诱导表达及表达产物分析4.3.3 重组菌TSG2013表达条件的优化4.4 本章小结第五章 TSG2013海藻糖合成酶的酶学性质研究5.1 实验材料5.1.1 菌株5.1.2 主要试剂5.1.3 主要仪器5.1.4 培养基5.2 实验方法5.2.1 菌体培养与粗酶液的制备5.2.2 海藻糖合成酶酶学性质的研究5.3 分析方法5.4 实验结果与分析5.5 本章小结第六章 结论与创新点6.1 结论6.2 创新点参考文献致谢附录A （攻读学位期间发表论文目录）
相关论文文献
标签：菌种筛选论文; 克隆和表达论文; 人工合成序列论文; 酶学性质论文;
