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RhoA/ROCK信号通路在TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

2020-12-06阅读(340)

RhoA/ROCK信号通路在TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

论文摘要

目的:探讨RhoA/ROCK信号通路在TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）转分化中的作用。方法:（1）采用腹腔注射胰蛋白酶法,分离培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,经倒置相差显微镜和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）鉴定;（2）常规传代,取第二代腹膜间皮细胞用于实验,培养的细胞静止24h后,随机分为正常对照组和TGF-β1（10ng/ml）刺激组两组,分别用半定量RT-PCR、Western Blot和间接免疫荧光（Immunofluorescence,IF）法观察不同时间α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,E-钙黏蛋白（E-cadherin）、胶原Ⅰ（CollagenⅠ）、波形蛋白（Vimentin）以及RhoA（包括总RhoA及活化的RhoA）mRNA和/或蛋白的表达;（3）取第二代融合后的腹膜间皮细胞,静止24h后随机分为以下4组:正常对照组,TGF-β1（10ng/ml）刺激组,TGF-β1（10ng/ml）+Y-27632（ROCK特异性抑制剂,10μM）组,Y-27632（10μM）组,分别用半定量RT-PCR、Western Blot和间接免疫荧光法检测E-cadherin、α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin mRNA和蛋白表达。结果:（1）经鉴定,95%以上的培养细胞为RPMCs。（2）半定量RT-PCR显示,TGF-β1刺激组E-cadherin mRNA表达水平与对照组比呈时间依从性减弱（12h、24h、48h P＜0.05）;α-SMA和CollagenⅠmRNA表达水平均呈时间依从性增加,其中α-SMA mRNA表达水平从6h开始与对照组比均增加（P＜0.05）,24h达高峰,之后减弱;CollagenⅠmRNA表达水平从12h开始与对照组比均增加（P＜0.05）,其中24h达高峰,较对照组显著增加（P＜0.01）,之后减弱。Western Blot和IF均显示,TGF-β1刺激组E-cadherin蛋白表达从24h起与对照组比明显减少（P＜0.05）,α-SMA、CollagenⅠ及Vimentin蛋白表达呈时间依从性表达上调,在24h、48h与对照组比有统计学差异（P＜0.05）。外源性TGF-β1刺激RPMCs能诱导RhoA活化,于10分钟开始出现活性升高,是对照组的（2.57±0.52）倍（P＜0.05）,1小时达高峰,是对照组的（4.35±0.41）倍（P＜0.05）,之后活化RhoA的表达逐渐减弱。（3）半定量RT-PCR、Western Blot和IF分别显示,TGF-β1+Y-27632组E-cadherin mRNA和蛋白表达水平较TGF-β1刺激组无增加（P＞0.05）,α-SMA和CollagenⅠmRNA表达水平较TGF-β1刺激组各降低了25.4%和55.7%（P＜0.05）,α-SMA、Vimentin和CollagenⅠ蛋白表达水平较TGF-β1刺激组分别降低了30.0%、60.3%和58.1%（P＜0.05）。结论:（1）外源性TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞发生EMT并上调活性RhoA的表达;（2）RhoA/ROCK通路选择性抑制剂Y-27632下调TGF-β1诱导的α-SMA、CollagenⅠ和Vimentin表达,抑制EMT,但对E-cadherin没有影响;（3）TGF-β1可通过RhoA/ROCK信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词简表
  • 第一章 前言
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 动物及来源
  • 2.1.2 主要仪器
  • 2.1.3 主要试剂
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 大鼠原代腹膜间皮细胞的分离与培养
  • 2.2.2 细胞传代
  • 2.2.3 免疫组织化学方法鉴定腹膜间皮细胞
  • 2.2.4 腹膜间皮细胞的活力测定
  • 2.2.5 腹膜间皮细胞增殖实验
  • 2.2.6 实验分组
  • 2.2.7 RT-PCR检测
  • 2.2.8 Western Blot
  • 2.2.9 膜蛋白的提取
  • 2.2.10 间接免疫荧光检测E-cadherin、α-SMA和CollagenⅠ的表达
  • 2.3 统计学处理
  • 第三章 实验结果
  • 3.1 大鼠原代腹膜间皮细胞的鉴定
  • 3.2 大鼠原代腹膜间皮细胞活力测定
  • 3.3 大鼠原代腹膜间皮细胞增殖实验结果
  • 3.4 RNA的检测
  • 3.5 TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞RhoA活化
  • 3.6 TGF-β1对大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响
  • 3.6.1 RPMCs形态改变
  • 3.6.2 TGF-β1对E-cadherin表达的影响
  • 3.6.3 TGF-β1对α-SMA表达的影响
  • 3.6.4 TGF-β1对Vimentin蛋白表达的影响
  • 3.6.5 TGF-β1对CollagenⅠ表达的影响
  • 3.7 Y-27632对大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响
  • 3.7.1 E-cadherin的表达
  • 3.7.2 α-SMA的表达
  • 3.7.3 Vimentin蛋白的表达
  • 3.7.4 CollagenⅠ的表达
  • 第四章 讨论
  • 4.1 腹膜间皮细胞转分化
  • 4.2 RhoA/ROCK信号通路影响腹膜纤维化的可能机制
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 综述
  • 致谢
  • 攻读学位期间的主要研究成果

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