根癌农杆菌介导的GUS基因转化除虫菊再生体系的建立

论文摘要

除虫菊（Pyrethrum cinerariifolium Trev.）为菊科多年生宿根草本植物,是一种古老的世界上唯一集约化栽培的天然杀虫植物。采用组织培养技术,可以有效地保存除虫菊的优良品种,以满足生产上的需要。通过建立除虫菊的高效稳定再生体系,转入相关的目的基因,可以培育高除虫菊酯含量的除虫菊品种。本论文是在前人的研究基础上,通过对6-BA和IBA不同浓度的配比,暗培养时间,AgN03浓度等条件的研究,进一步稳定和优化了‘No.39’基因型的再生体系。并且通过对卡那霉素的浓度,头孢霉素的浓度,暗培养时间,预培养时间和侵染时间的探索,结合PCR和GUS染色检测,初步建立了除虫菊遗传转化体系。其主要研究结果如下：1.优化了除虫菊‘No.39’基因型再生体系以除虫菊‘No.39’基因型叶片为外植体,对进一步稳定和优化其再生体系进行研究,探讨了6-BA和IBA不同浓度配比对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响,暗培养时间对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响,AgNO3对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响。结果表明：6-BA和IBA不同浓度配比对除虫菊叶片外植体再生的影响比较显著,当6-BA和IBA的浓度分别为2.0mg/L和0.2mg/L时,叶片的再生率最高为86.7%,平均每叶再生芽数为1.5个。低浓度的AgN03对除虫菊‘No.39’叶片的再生有明显的促进作用,当AgN03浓度为2mg/L时,叶片的再生率最高为90%,平均每叶再生芽数为2.4个。6-BA和IBA不同浓度配比,AgN03的浓度基本上与前人的研究结果一致。而暗培养的时间稍有差异,在本试验中,暗培养2周的除虫菊‘No.39’基因型叶片再生率最高为90%,平均每叶再生芽数为2.2个。因此,筛选出6-BA和IBA的最佳组合浓度为6-BA2.0mg/L和IBA0.2mg/L, AgNO3的浓度为2mg/L,暗培养时间为2周。2.初步建立了除虫菊遗传转化体系以除虫菊‘No.39’基因型叶片为外植体,探讨了卡那霉素的浓度,头孢霉素的浓度,暗培养时间,预培养时间和侵染时间对除虫菊遗传转化的影响。结果表明：除虫菊叶片对卡那霉素非常敏感,10mg/L的浓度几乎就可以完全抑制非转化苗的再生。预培养时间能明显的提高除虫菊的转化率,但是预培养的时间也不是越长越好。侵染时间的长短对除虫菊的转化也有一定的影响,侵染时间过长或者过短都会影响转化率。通过研究,我们筛选出除虫菊适宜的卡那霉素浓度为10mg/L,头孢霉素浓度为200mg/L,暗培养时间为2周,预培养时间为2d,侵染时间为5min。3.抗性苗的PCR和GUS染色检测从除虫菊‘No.39’基因型获得的抗性苗中选取8株用CTAB法提取DNA,进行PCR检测结果表明：8株抗性植株均显示为PCR阳性植株。进一步对抗性苗的叶片进行GUS染色检测,其结果表明只有其中1株（4号）叶片呈蓝色,为阳性植株反应,其它阳性植株均无蓝色反应。对该阳性植株进行整株GUS染色时,其根、茎和叶都被染成了蓝色。由此可见,GUS基因已经稳定地转入到除虫菊‘No.39’基因型苗中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词（Abbreviation）
• 1 前言
• 1.1 组织培养研究进展
• 1.1.1 除虫菊组培快繁研究
• 1.1.2 除虫菊再生研究
• 1.2 关于植物遗传转化
• 1.2.1 基因枪介导法
• 1.2.2 原生质体介导法
• 1.2.3 花粉管通道法
• 1.2.4 农杆菌介导法
• 1.2.5 植物原位转化的方法
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 除虫菊再生体系的建立
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 培养基
• 2.1.1.3 培养条件
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 除虫菊无菌苗体系的建立
• 2.1.2.2 6-BA和IBA不同浓度配比对除虫菊叶片再生的影响
• 2.1.2.3 暗培养时间对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响
• 3对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响'>2.1.2.4 AgNO₃对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响
• 2.1.2.5 不同基因型对除虫菊直接再生的影响
• 2.2 除虫菊遗传转化体系的建立
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2.1 植物材料
• 2.2.2.2 根癌农杆菌菌株及质粒
• 2.2.2.3 分子生物学试剂
• 2.2.2.4 主要仪器和设备
• 2.2.2.5 培养基及添加成分
• 2.2.2.6 常用溶液
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 根癌农杆菌的活化及工程菌液的制备
• 2.2.2.2 卡那霉素浓度和暗培养时间的影响
• 2.2.2.3 头孢霉素浓度的影响
• 2.2.2.4 预培养和侵染时间的影响
• 2.2.2.5 抗性苗叶片和整株的染色
• 2.2.2.6 抗性苗叶片DNA的提取
• 2.2.2.7 抗性苗叶片PCR的检测
• 2.2.3 数据统计及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 除虫菊叶片再生体系的建立
• 3.1.1 6-BA和IBA不同浓度配比对除虫菊‘No.39’叶片再生的影响
• 3.1.2 暗培养时间对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响
• 3对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响'>3.1.3 AgNO₃对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响
• 3.1.4 不同的基因型对除虫菊再生的影响
• 3.2 除虫菊遗传转化体系的建立
• 3.2.1 卡那霉素浓度和暗培养时间对除虫菊遗传转化的影响
• 3.2.2 头孢霉素浓度对除虫菊遗传转化的影响
• 3.2.3 预培养时间和侵染时间对除虫菊遗传转化的影响
• 3.2.4 抗性苗叶片的PCR检测
• 3.2.5 抗性苗叶片的GUS染色结果
• 4 结论与讨论
• 4.1 除虫菊‘No.39’基因型再生体系的优化
• 4.1.1 6-BA和IBA不同浓度对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响.
• 4.1.2 暗培养时间对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响
• 3对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响'>4.1.3 AgNO₃对除虫菊‘No.39’基因型叶片再生的影响
• 4.2 除虫菊遗传转化体系的建立
• 4.2.1 选择压的影响
• 4.2.2 预培养和侵染时间的影响
• 4.2.3 抗性筛选出现假阳性的原因
• 参考文献
• 致谢