PIk1通过与p53的相互作用参与G2/M期的转换调控

论文摘要

在整个周期进程中,细胞顺利完成G2/M期的转换是实现细胞增殖的一个关键步骤。由于细胞自身存在G2期DNA损伤检验点的监控机制,所以可以保证G2/M期转换的顺利实现。由于Polo like激酶（Plk1）和p53分别是通过正、负调控机制在G2/M转换过程发挥重骂的作用,并且有研究表明Plk1可以参与调节p53的活性。因此,本文致力研究Plk1是否可以通过调节p53蛋白参与G2/M期转换过程的调控。主要结果如下: 1.将同步化在G2期的细胞释放培养,Plk1的激酶活性上升,说明细胞由G2期顺利地向M期过渡。采用低剂量UV照射的方法处理同步化在G2期的细胞,使Plk1的激酶活性受到抑制,并且伴随着蛋白表达水平的降低,而p53的转录活性升高、蛋白大量积聚。 2.通过细胞免疫共沉淀实验证实,在G2/M期Plk1与p53发生物理性的结合。酵母双杂交实验进一步确证Plk1与p53的DNA结合区域发生直接结合作用。表明Plk1可能是通过竞争性结合p53的DNA结合区域来抑制p53转录活性。在细胞内过表达Plk1也证明p53的转录活性受到抑制。 3.细胞内过表达Plk1可以抑制p53蛋白的磷酸化;共同过表达Plk1和Mdm2可以加剧Mdm2介导p53的泛素化降解;过表达Plk1还可以促使p53蛋白被转运出细胞核。表明Plk1可以通过抑制p53的磷酸化、促进p53蛋白降解以及抑制p53的入核作用来影响p53的蛋白稳定性和转录活性。 4.Plk1和hNRAGE分别作用于p53的不同区域,Plk1抑制p53的转录活性,而hNRAGE上调p53的转录活性,当两者共同作用后会相互抵消对p53的作用。hNRAGE对Plk1的激酶活性没有影响。表明Plk1和hNRAGE可能作为两个独立的信号分子参与调节p53。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 一、细胞增殖与细胞周期
• 二 Plk1在细胞周期调控中的研究进展
• 三 p53在细胞周期调控中的研究进展
• 四 细胞周期中的DNA损伤检验点
• 2/M期 Plk1和p53的影响'>第一章 UV照射对 G₂/M期 Plk1和p53的影响
• 1. 材料与方法
• 1.1 真核表达质粒的构建
• 1.2 细胞培养，药物同步化，UV照射和质粒的磷酸钙转染
• 1.3. p21Cip1荧光素酶活性的检测
• 1.4. Plk1激酶活性的检测
• 1.5 蛋白印迹
• 1.6 流式细胞仪分析（FACS）细胞周期
• 2. 实验结果
• 2期进入 M期，Plk1的激酶活性升高'>2.1 同步化细胞由G₂期进入 M期，Plk1的激酶活性升高
• 2/M期，UV照射引起 Plk1激酶活性和蛋白水平下降，p53转录活性和蛋白水平上升'>2.2. G₂/M期，UV照射引起 Plk1激酶活性和蛋白水平下降，p53转录活性和蛋白水平上升
• 3. 讨论
• 第二章 Plk1与p53的结合作用
• 1. 材料方法
• 1.1 细胞培养，药物同步化，UV照射，ADR药物损伤和质粒的磷酸钙转染
• 1.2 免疫共沉淀和蛋白印迹
• 1.3 酵母表达质粒的构建
• 1.4. LiAc法共转化酵母双杂交
• 1.5. p21Cip1荧光素酶活性的检测
• 2. 实验结果
• 2.1 内源性的Plk1和p53蛋白在细胞体内发生结合
• 2.2. Plk1和p53在酵母细胞中直接结合
• 2.3. Plk1抑制受UV/ADR激活升高的p53介导p21的转录活性
• 3. 讨论
• 第三章 Plk1对p53的调节作用
• 1. 材料与方法
• 1.1 细胞培养，UV照射和质粒的磷酸钙转染
• 1.2 免疫印迹
• 1.3. Plk1激酶活性的检测
• 1.4 免疫荧光染色
• 2. 实验结果
• 2.1. Plk1抑制 UV照射诱导的p53（Ser-15）的磷酸化
• 2.2. Plk1协同Mdm2途径促进p53蛋白的降解
• 2.3. Plk1抑制UV照射诱导的p53入核的过程
• 2.4. p53不影响 Plk1的蛋白水平和激酶活性
• 3. 讨论
• 第四章 Plk1和hNRAGE对p53调节作用
• 1. 材料与方法
• 1.1 细胞培养，UV照射和质粒的磷酸钙转染
• 1.2 免疫印迹
• 1.3. p21Cip1素酶活性的检测
• 2. 实验结果
• 2.1. hNRAGE不影响 Plk1的蛋白水平以及激酶活性
• 2.2. Plk1和hNRAGE共同调节p53介导p21的转录活性
• 3. 讨论
• 总结
• 附录1 实验材料与仪器
• 附录2 攻读硕士学位论文期间的文章
• 致谢