柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及EtSerpin，EtAMA1基因功能的初步研究

论文摘要

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前主要以药物和疫苗预防为主,但由于抗药性、药物残留和散毒等问题的出现,需要人们寻找新的防治手段。球虫体外培养体系可为探讨球虫的生长发育机制和筛选防治球虫病的新药物和疫苗候选抗原提供重要的技术平台。1.柔嫩艾美耳球虫的DF-1细胞培养体系的建立为了寻找适合球虫入侵和发育的本体传代细胞培养体系,本研究首次建立了DF-1传代细胞球虫体外培养体系。子孢子入侵DF-1细胞后60 h左右发育为第1代成熟裂殖体,72 h左右释放出第1代裂殖子。将巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子分别接种DF-1细胞体系,仅观察到毒害艾美耳球虫可以入侵DF-1在72 h内发育为第一代裂殖子。巨型艾美耳球虫的子孢子虽可以入侵DF-1细胞,但不能继续发育。柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子接种DF-1细胞后未见虫体入侵和发育。建立了适合球虫发育的新细胞培养体系。2.柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系在子孢子入侵活力检测中的应用球虫传代细胞体系可作为探讨球虫生长发育机制、筛选抗球虫药物等研究的重要平台。本研究首次报道应用DF-1细胞培养体系建立了柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活力检测的技术。应用荧光探针CFDA-SE标记柔嫩艾美耳球虫子孢子,接种细胞后,收集细胞经流式细胞仪区分为子孢子入侵的细胞、未入侵的细胞和游离的子孢子,计算子孢子的入侵率,从而建立对子孢子入侵细胞的量化方法。在37℃和41℃培养条件下,柔嫩艾美耳球虫子孢子对DF-1细胞的入侵活力均优于MDBK、VERO、BHK、MDCK细胞。对DF-1检测体系的培养条件进一步优化,确定最佳培养程序为:将生长状态较佳的的DF-1细胞经胰酶消化后,以每孔10万个细胞剂量铺被24孔板,在含10%血清的DMEM,37℃,5% CO2培养24 h后,用含5%血清浓度的DMEM换液,每孔接入30万CFDA-SE荧光标记的子孢子,41℃,5% CO2培养812 h,胰酶消化后收集DF-1细胞进行检测。3.柔嫩艾美耳球虫的Serpin和AMA1基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析根据柔嫩艾美耳球虫Serpin和AMA1基因的ESTs序列,利用RACE技术扩增获得Serpin和AMA1基因的全长cDNA序列,其中Serpin基因的全长1 918 bp,Genbank登录号为:HQ830031。该序列含有一个1 245 bp的ORF,编码414个aa,理论分子量45.5 kDa,等电点为5.26。该蛋白前端具有29个aa的信号肽,其中第16个aa为蛋白的胞内区域,第729个aa为跨膜区域,第30414个aa为胞外区域,该蛋白为分泌性表达蛋白,具有丝氨酸蛋白酶抑制因子的保守结构域。该基因编码的蛋白与已登录的柔嫩艾美耳球虫Serpin具有100%的相似性。选取8种物种Serpin基因序列构建进化树分析,发现在进化上与弓形虫更为接近。AMA1基因全长2 349 bp,Genbank登录号:JN032081。该序列含有一个1 608 bp ORF,编码535个aa,理论分子量58 kDa,等电点为5.79,该蛋白前端具有信号肽结构,其断裂位点位于第23个aa和第24个aa之间。第1446个aa为蛋白的胞外区域,第447469个aa为跨膜区域,第470535个aa为蛋白的胞内区域。具有顶体膜抗原的保守结构域。选取9种顶复器原虫的AMA1基因序列进行进化树分析,结果发现与巨型艾美耳球虫、弓形虫和新孢子虫的亲缘关系较近。利用荧光定量PCR对柔嫩艾美耳球虫的Serpin和AMA1基因在不同发育阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子）的表达情况进行分析,结果可见两个基因均在子孢子阶段高表达。4.柔嫩艾美耳球虫Serpin基因的原核表达及功能的初步研究将获得的柔嫩艾美耳球虫Serpin基因的表达序列连接到原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组表达质粒pET-28a-Serpin,并在大肠杆菌中诱导表达,纯化获得重组融合蛋白rEtSerpin,具有凝乳蛋白酶活性。利用Western-blot分析表明rEtSerpin具有良好的抗原性。用纯化的rEtSerpin免疫家兔获得多抗血清,可识别虫体中大小为45.5 kDa的天然Serpin蛋白。rEtSerpin多抗血清可明显抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞。利用免疫荧光技术对柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞发育过程中Serpin蛋白（EtSerpin）的动态分布进行观察,结果可见当子孢子入侵宿主细胞时,EtSerpin聚集于子孢子的顶部;虫体进入细胞后,EtSerpin由虫体分泌到宿主细胞内,形成点状分布。滋养体和裂殖体表面均大量表达EtSerpin,但当第一代裂殖子逸出时,EtSerpin分布在裂殖子的细胞质。同时也利用免疫荧光技术对柔嫩艾美耳球虫在盲肠发育过程中EtSerpin的动态分布进行观察,结果发现子孢子可在卵囊接种后24 h左右移行至盲肠,EtSerpin均匀分布于子孢子的细胞质中。当子孢子开始发育时,EtSerpin表达量增高,大量表达于滋养体和裂殖体的表面,与宿主细胞间形成保护屏障,当裂殖体释放出裂殖子时,可见EtSerpin均匀分布在虫体的细胞质中。当虫体进入有性生殖阶段,发育为大小配子体,则虫体内的Serpin蛋白表达量降低,当虫体发育为未孢子化卵囊时,EtSerpin在卵囊壁周围聚集,而在卵囊细胞质中含量较少。以上研究表明EtSerpin在细胞入侵、生长发育、逃避宿主免疫应答中可能具有重要作用。对应用rEtSerpin蛋白免疫鸡,结果发现,rEtSerpin免疫组鸡只增重（60μg/只,103.25%）略好于感染对照组（PBS,93.22%）。免疫组的病变积分（1.75）与感染对照组（2.00）差异不显著,但从粪便卵囊产量来看,免疫组与感染对照组差异显著,且较高剂量免疫组的卵囊产量明显低于低剂量免疫组的卵囊产量。利用ELISA方法对免疫前后rEtSerpin抗体效价的测定,结果可见:一免后7 d的鸡体内明显产生了rEtSerpin特异性IgG抗体,且鸡体内可以持续较长时间。5.柔嫩艾美耳球虫AMA1基因的原核表达及功能的初步研究将获得的柔嫩艾美耳球虫AMA1基因的胞外序列连接到原核表达载体pGEX-6P-1中,成功构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-AMA1,并在大肠杆菌中诱导表达,纯化获得重组融合蛋白rEtAMA1。Western-blot分析表明rEtAMA1具有良好的抗原性。用纯化的rEtAMA1免疫家兔获得特异性多抗血清。该血清可显著抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞。利用免疫荧光技术对柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞发育过程中AMA1蛋白（EtAMA1）的动态分布进行观察,结果可见子孢子准备入侵宿主细胞前,EtAMA1大量表达于子孢子表面,且顶部的EtAMA1表达量增加明显;进入细胞后子孢子的EtAMA1主要集中在子孢子的表面,当子孢子开始发育时,EtAMA1均匀分布于整个虫体;当发育为滋养体时,其表达量大量增高,当子孢子发育为第一代未成熟裂殖体时,裂殖体表面的蛋白表达量减少;当发育为成熟裂殖体时,EtAMA1主要分布于裂殖子的表面,裂殖体表面EtAMA1的含量明显降低;当裂殖体释放出裂殖子时,可见裂殖子表面的EtAMA1大量集中在虫体的顶部,且裂殖体的表面残留大量的EtAMA1。同时也利用组织免疫荧光技术对柔嫩艾美耳球虫在盲肠发育过程中EtAMA1的动态分布进行观察,结果发现子孢子粘附于盲肠上皮细胞时,子孢子表面表达大量EtAMA1,尤其顶端的表达量明显;当子孢子发育为第一代裂殖体时,EtAMA1表达于裂殖体表面,当裂殖体释放出第一代裂殖子时,可见EtAMA1主要集中于裂殖子顶端表达;当虫体发育为第二代裂殖体时,EtAMA1主要集中在裂殖体内的裂殖子的表面,而裂殖体表面基本没有EtAMA1的表达;当虫体发育为第三代裂殖体时,虫体的EtAMA1分布于裂殖体的表面,内部的蛋白呈点状分布;当虫体进入有性生殖阶段时,可以明显观察到EtAMA1在大小配子体的不同分布,小配子体内的小配子EtAMA1表达量显著增多,而大配子体中的EtAMA1含量降低,且在大小配子体形成合子中有大量点状分布的EtAMA1,合子表面也大量分布着EtAMA1;当虫体发育为未孢子化卵囊时,EtAMA1表达量降低,在未孢子化卵囊的细胞质中基本上不表达,仅少量存在于卵囊壁周围。以上结果提示EtAMA1蛋白在细胞入侵、裂殖释放及合子的形成中可能具有重要作用。对rEtAMA1的免疫保护效果进行评价,结果EtAMA1免疫组在鸡只增重、病变积分和粪便卵囊产量上均优于感染对照组,且高剂量（100μg/只）免疫组的保护效果总体好于低剂量免疫组（50μg/只）。鸡只在二免后7 d,EtAMA1免疫组均产生了较高的抗体水平,并可持续较长时间。鸡只在攻虫后,盲肠中的细胞免疫水平受到明显抑制,但高剂量免疫组（100μg/只）的细胞免疫水平好于感染对照组。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 鸡球虫病的危害及防治现状
• 1.2 鸡球虫细胞培养的研究现状及进展
• 1.2.1 球虫细胞培养体系的筛选及优化
• 1.2.2 细胞培养技术在抗球虫制剂评价方面的应用
• 1.2.3 细胞培养技术在球虫蛋白研究方面的应用
• 1.2.4 细胞培养技术在球虫基因转染研究方面的应用
• 1.2.5 细胞培养技术在球虫入侵机理研究方面的应用
• 1.2.6 展望
• 1.3 原虫的丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin）研究进展
• 1.3.1 Serpin 的结构及分类
• 1.3.2 Serpin 的功能
• 1.3.3 几种原虫的Serpin 的研究进展
• 1.3.4 展望
• 1.4 顶复器原虫顶体膜抗原1（AMA1）的研究进展
• 1.4.1 AMA1 的结构特征
• 1.4.2 AMA1 的生物合成和运输
• 1.4.3 AMA1 的形态多态性
• 1.4.4 AMA1 的功能作用
• 1.4.5 AMA1 的天然免疫原性
• 1.4.6 AMA1 的疫苗研制
• 1.4.7 其他原虫的AMA1 研究进展
• 1.4.8 展望
• 第二章 柔嫩艾美耳球虫 DF-1 细胞培养体系的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 实验虫株及细胞株
• 2.2.3 主要试剂和耗材
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 柔嫩艾美耳球虫子孢子的制备
• 2.2.6 DF-1 细胞培养和制备
• 2.2.7 柔嫩艾美耳球虫的DF-1 细胞培养体系建立
• 2.2.8 不同培养温度下子孢子在DF-1 细胞中的发育
• 2.2.9 其他鸡球虫在DF-1 细胞体系的培养
• 2.2.10 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子在 DF-1 细胞体系的培养
• 2.3 结果
• 2.3.1 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和子孢子的收集和纯化
• 2.3.2 柔嫩艾美耳球虫的DF-1 细胞培养体系建立
• 2.3.3 不同培养温度下子孢子在DF-1 细胞中的发育
• 2.3.4 其他鸡球虫在DF-1 细胞体系的培养
• 2.3.5 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子在DF-1 细胞体系的培养
• 2.4 讨论
• 第三章 DF-1 细胞培养体系在子孢子入侵活力检测中的应用
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 实验虫株及细胞株
• 3.2.3 主要试剂和耗材
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 柔嫩艾美耳球虫子孢子的制备
• 3.2.6 子孢子入侵DF-1 细胞的活力检测
• 3.2.7 子孢子入侵五种培养细胞的活力比较
• 3.2.8 促进虫体入侵DF-1 细胞的培养条件优化
• 3.3 结果
• 3.3.1 柔嫩艾美耳球虫子孢子的荧光标记
• 3.3.2 子孢子入侵DF-1 细胞后的定量检测
• 3.3.3 子孢子入侵活力的最佳检测时间确定
• 3.3.4 荧光标记子孢子的最佳保存时间
• 3.3.5 子孢子对五种培养细胞的入侵活力比较
• 3.3.6 促进虫体入侵DF-1 细胞的培养条件优化
• 3.4 讨论
• 第四章 柔嫩艾美耳球虫的 Serpin 基因和 AMA1 基因的克隆与生物信息学分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 实验虫株
• 4.2.3 主要试剂及耗材
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 EST 来源
• 4.2.6 柔嫩艾美耳球虫子孢子的收集
• 4.2.7 柔嫩艾美耳球虫子孢子总 RNA 的提取
• 4.2.8 目的基因的3’ 和5’ RACE 扩增
• 4.2.9 扩增 3’cDNA 末端和 5’cDNA 末端
• 4.2.10 Nested PCR
• 4.2.11 PCR 产物的胶回收
• 4.2.12 回收PCR 产物的连接转化
• 4.2.13 阳性克隆的PCR 鉴定及测序
• 4.2.14 目的基因全长序列的拼接
• 4.2.15 目的基因全长cDNA 序列的扩增
• 4.2.16 目的基因全长cDNA 的克隆和测序
• 4.2.17 目的基因编码蛋白的生物信息学分析
• 4.2.18 目的基因在不同发育时期虫体的表达分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 柔嫩艾美耳球虫各阶段虫体总RNA 的提取
• 4.3.2 柔嫩艾美耳球虫BG611 和BG589 基因全长cDNA 的获取
• 4.3.3 BG611 基因 cDNA 序列的生物信息学分析
• 4.3.4 BG589 基因 cDNA 序列的生物信息学分析
• 4.3.5 目的基因在不同发育阶段虫体的表达分析
• 4.4 讨论
• 第五章 柔嫩艾美耳球虫Serpin 基因的原核表达及功能初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组原核表达质粒的构建
• 5.3.2 rEtSerpin 在大肠杆菌中的表达
• 5.3.3 rEtSerpin 的包涵体纯化
• 5.3.4 rEtSerpin 的抗原性分析
• 5.3.5 rEtSerpin 抑制蛋白酶活性效果测定
• 5.3.6 抗rEtSerpin 多抗血清对虫体天然蛋白的识别
• 5.3.7 rEtSerpin 多抗血清对子孢子入侵细胞的抑制作用
• 5.3.8 EtSerpin 的体外荧光定位
• 5.3.9 EtSerpin 的鸡组织荧光定位
• 5.3.10 rEtSerpin 的免疫保护性试验
• 5.4 讨论
• 第六章 柔嫩艾美耳球虫AMA1 基因的原核表达及功能初步研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 实验方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 重组原核表达质粒的构建
• 6.3.2 rEtAMA1 在大肠杆菌中的表达
• 6.3.3 rEtAMA1 的抗原性分析
• 6.3.4 rEtAMA1 特异多抗血清对子孢子入侵细胞的抑制作用
• 6.3.5 EtAMA1 的体外荧光定位
• 6.3.6 EtAMA1 的鸡组织荧光定位
• 6.3.7 rEtAMA1 的免疫保护性试验
• 6.4 讨论
• 第七章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历