肿瘤细胞基质金属蛋白酶活性的动态光学成像

论文摘要

基质金属蛋白酶（Matrix Metaloproteinases,MMPs）是一种可降解细胞外基质的蛋白水解酶,在恶性肿瘤的生长、侵袭、转移和血管生成过程中起着重要的作用。基质金属蛋白酶抑制剂作为新型抗肿瘤药物,在肿瘤治疗方面具有良好的开发与应用潜力。建立实时在体检测MMPs活性的方法,对于高通量在体筛选MMPs抑制剂具有重要的作用。1应用基因工程技术合成用于在体检测水解酶活性的荧光共振能量转移（FRET）探针,通过FRET成像能动态监测在体外和不同细胞表达水解酶的活性。本研究中应用基因工程技术合成了两对可用于在活细胞或活动物体内检测MMPs活性的荧光共振能量转移（FRET）探针,此FRET探针设计原理为:将能发生FRET的荧光蛋白对CFP/YFP或CFP/DsRed用MMPs识别的肽相连,构建成YFP-MMPs底物识别序列-CFP或DsRed- MMPs底物识别序列-CFP的融合蛋白。在体外利用纯化的荧光探针对MMP酶的活性及抑制剂的作用进行了实时动态的光谱学分析,而且此探针对MMP2具有较高的酶切特异性。将这两个探针用展示技术锚定在细胞膜的外表面,用于检测分泌到细胞外的MMPs活性。当细胞外液无MMPs时,此FRET探针保持其完整性时,CFP与YFP或CFP与DsRed之间能够发生荧光共振能量转移;当肿瘤细胞高表达MMPs,分泌到细胞外液中的MMPs活性较高时,FRET探针被MMPs裂解,使得荧光受体蛋白YFP或DsRed游离到细胞外液中,而荧光供体蛋白CFP仍保留在肿瘤细胞上。因此,无论是通过FRET荧光成像还是单独检测YFP或DsRed荧光信号,均能灵敏地反映肿瘤细胞的MMPs活性。本研究中,将此FRET探针分别转染到MDA-MB 435s细胞（高表达MMP s）和MCF-7细胞（低表达MMPs）,筛选稳定表达荧光探针的细胞株,利用FRET技术在活细胞内实时监测了MMPs的活性及MMPs抑制剂GM6001的作用。此外,将稳定表达FRET探针DsRed- MMP识别序列-CFP的MDA-MB 435s细胞接种在无壳鸡胚尿囊膜上,通过监测DsRed和CFP的荧光比例信号在体反映肿瘤生长过程中的MMP活性,同时用MMPs抑制剂GM6001作用于肿瘤3天,发现消失的DsRed荧光信号明显增强,结果表明构建的FRET探针能够灵敏在体地检测金属蛋白酶的活性。因此,所构建的荧光探针可以灵敏地检测MMP的活性并用于MMP抑制剂的活体的抗癌药物的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 金属蛋白酶概述
• 1.2 MMP 在肿瘤中的作用
• 1.3 基质金属蛋白酶抑制剂（MMP inhibitor,MMPI）
• 1.4 荧光共振能量转移技术
• 1.5 活体光学分子成像技术检测蛋白酶的研究进展
• 1.6 本文研究的内容
• 2 体外荧光共振能量转移方法检测MMP 的活性
• 2.1 引言
• 2.2 FRET 荧光蛋白基因的构建表达及纯化
• 2.3 诱导表达并纯化重组FRET 荧光蛋白与重组MMP2 蛋白
• 2.4 体外荧光光谱方法FRET 检测MMP 的活性
• 2.5 讨论与小结
• 3 细胞水平FRET 分析MMP 的酶活
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论与小结
• 4 鸡胚尿囊膜上荧光分析肿瘤细胞表达MMP 的酶活
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论与小结
• 5 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读学位期间发表的论文目录
• 附录2 本论文所用英文缩写名称一览表
• 附录3 Matlab 程序