论文摘要
背景和目的：DJ-1是一个与家族性的帕金森病相关的遗传基因.它编码一个含189个氨基酸的蛋白DJ-1。DJ-1蛋白属于ThiJ/Pfpl家族,广泛表达于人体组织以及脑区。对于DJ-1功能的研究,目前主要认为它是一个伴侣蛋白和抗氧化因子。异常蛋白的错误折叠和线粒体功能缺失是PD发病的两个主要机理,DJ-1在这个过程中表现保护作用,其功能的缺失或减少将可能导致神经退行性病变。本课题的前期工作用蛋白组学的方法来筛选与DJ-1有相互作用的蛋白。在鱼藤酮处理的MES细胞中,鉴定出了306个与DJ-1相关的蛋白,Mortalin就是其中之一。Mortalin是热休克蛋白70家族成员之一,它由679个氨基酸组成,它的结构与其他Hsp70家族成员相似,包括两个结构域：ATP酶结构域和C末端的蛋白结合结构域。由于它主要定位于线粒体,因此又被称为线粒体热休克蛋白70。研究表明,Mortalin参与了多种生理功能的调控,包括细胞存活,细胞增殖,应激,线粒体合成,细胞内转运等,并且可能在神经系统疾病中发挥作用。Mortalin与帕金森病的联系,最早是在分析帕金森病人脑黑质与对照蛋白表达差异中筛选得到的。我们前期的实验通过定量蛋白组学的方法发现Mortalin在帕金森病人的线粒体富集组分中显著下降。我们这个课题的主要目标就是确定DJ-1和Mortalin之间的物理性相互作用,并探究这种物理性相互作用是否会影响功能。实验方法：1、PC12和SH-SY5Y细胞培养以及细胞转染；2、表达纯化GST融合蛋白；3、用GST Pull-down的方法检测DJ-1和Mortalin的相互作用；4、用免疫共沉淀的方法检测DJ-1和Mortalin的相互作用；5、用细胞免疫荧光化学方法检测DJ-1和Mortalin亚细胞定位情况；6、用MTT法检测细胞活性；7、用荧光素酶重折叠实验检测蛋白重折叠功能。实验结果：1、以C57小鼠脑组织总蛋白提取物作为GST Pull-down体系,用DJ-1蛋白作为诱饵蛋白,我们并没有在沉淀下来的DJ-1的蛋白复合物中检测到Mortalin。2、以C57小鼠脑组织总蛋白提取物,PC12细胞总蛋白提取物,或者SH-SY5Y细胞总蛋白提取物等内源性系统作为免疫共沉淀体系,用DJ-1蛋白作为诱饵蛋白,我们并没有在沉淀下来的DJ-1的蛋白复合物中检测到Mortalin。3、用鱼藤酮处理PC12细胞后,细胞免疫荧光化学的方法发现Mortalin与线粒体的共定位减少了。4、用鱼藤酮处理PC12细胞后,Western blotting的方法发现Mortalin在胞浆中的水平增高,而DJ-1的亚细胞定位没有发生明显的改变。5、用鱼藤酮处理PC12细胞后,细胞免疫荧光化学的方法发现DJ-1和Mortalin之间的共定位增加。6、针对鱼藤酮引起的细胞毒性,DJ-1可以起到保护细胞的作用,增加细胞活性。在荧光素酶热休克变性后,DJ-1可以促进它的重折叠,使其恢复增加。结论：1、在我们的实验体系中并未观察到DJ-1和Mortalin的相互作用。2、鱼藤酮处理后,Mortalin在细胞胞浆中的水平增高。3、DJ-1是一个抗氧化应激因子,并且具有伴侣蛋白作用。