论文摘要
本论文分为两个部分：与肝癌相关的人类新基因pp5644的生物学功能研究以及酵母双杂交系统载体质粒的改造与文库构建。在论文的第一部分，我们对人类新基因pp5644及其生物学功能进行了研究。pp5644基因编码一个124aa的蛋白，生物信息学分析提示它可能存在一个信号肽和coiled-coil结构。MTC—PCR表明，除了骨骼肌和胰腺外，pp5644在所检测的其他14种组织中都有表达，其中在脑、肾和卵巢组织表达最高。细胞定位结果表明pp5644主要呈点状、不均匀分布于细胞质中。细胞生长曲线和集落形成实验都表明pp5644基因的过量表达能够抑制肿瘤细胞株的生长。通过酵母双杂交筛选，我们得到了三个能够与pp5644发生相互作用的已知蛋白：4—磷酸肌醇接头蛋白1相关蛋白FASP1（FAPP1-associated protein 1）；NFκB关键调节因子NEMO（NFκB essential modulater），也被称为IKKγ；bZIP转录因子MafF（Homo sapiens v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog F）。酵母maitrig实验、体外GST Pull down实验和体内免疫共沉淀实验验证了这些相互作用的特异性。免疫荧光共定位实验显示pp5644与FASP1能够共定位于细胞质。而pp5644与MafF的细胞共定位实验则表明，当MafF与pp5644共同表达时，两者的细胞分布都发生了显著改变，MafF由细胞核内的均匀弥散分布变为一定的核仁区聚集，pp5644由细胞质的点状不均匀分布变为部分核内核仁区的明显聚集，这种改变使得两者能够共定位于核仁。我们对pp5644和MafF的相互作用进行了深入研究。系列缺失实验发现pp5644蛋白的第53位至96位氨基酸组成的Coiled-coil domain与MafF的第79至121位氨基酸的亮氨酸拉链结构域是两者发生相互作用的最小必要结构域。ONPG定量检测实验提示这两个片断之间的相互作用（pp5644△3和MafF△4）最强、最直接。对这两个片断的氨基酸序列分析和相互作用的计算机模拟，我们发现它们在氨基酸组成上非常相似，非典型的heptad-repeat中的d位点均为疏水氨基酸，都能够在蛋白折叠时形成一条疏水带。因此，在极性环境中，pp5644的这个区域能够与MafF的bZIP结构以疏水界面紧密结合，疏水基团被包埋，从而形成稳定的二聚体复合物。酵母和细胞转录激活实验发现，pp5644与MafF相互作用能够激活MafF特异识别、结合，但MafF单独不能激活的DNA顺式调节元件US2；同时相互作用最小片断pp5644△3也具有与全长pp5644几乎相同的辅助转录激活功能。上述实验证明pp5644能够作为一个辅助激活因子，与转录因子MafF一起实现转录调控功能。根据pp5644与FASP1、NEMO、MafF相互作用的研究，对它们的生物学意义进行讨论和思考，我们猜测pp5644可能通过这些相互作用参与不同的信号途径，影响多个重要基因的转录和表达，从而导致其过量表达抑制肿瘤细胞生长等细胞效应。pp5644很可能是一个重要的多功能基因。上述工作对pp5644的生物学功能提供了重要的证据和线索，对于将来深入研究pp5644基因的转录调控功能、抑制细胞生长的具体原因和过程、对肿瘤的影响等问题奠定了良好的基础。论文的第二部分，我们对所参与的人类肝脏蛋白质组计划（Humgn Liver Proteome Project，简称HLPP）的部分工作进行了总结，包括酵母双杂交系统载体质粒的改造和文库的构建。HLPP计划希望通过大规模酵母双杂交筛选，建立人类基因在肝脏中的蛋白连锁作用网络、从而揭示其功能和作用模式，这就首先需要建立一套适合高通量基因克隆的载体以及克隆方法。同时，为了充分利用资源以及开展我国特有基因库的研究，我们还希望建立中国人肝脏cDNA酵母双杂交文库。据此，我们首先对两套常用酵母双杂交系统的载体pPC86、pDBLeu和pGADT7、pGBKT7，以酶切插入合成寡核苷酸接头的方法进行了改造。经过酶切和DNA测序鉴定，成功获得了插入新多克隆位点、其中包含SfiⅠA和SfiⅠB位点的改造载体，它们分别被命名为NpPC86、NpDBLeu和NpGADT7、NpGBKT7。这些载体已经被实际地应用于大规模、高通量的基因克隆和酵母双杂交筛选工作。利用NpPC86、NpDBLeu载体，我们分别以中国人肝脏组织mRNA和购买的Clonech公司成人肝mRNA为来源，采用SMART技术反转录PCR获得dscDNA，酶切回收后与SfiⅠ酶切处理后的载体连接，转化XL10-Gold高效大肠杆菌感受态细胞，收获转化子，最后分别获得了NpPC86中国人肝脏cDNA文库和NpDBLeu肝脏cDNA文库。原始文库经过了转化子计数、重组率和插入片断大小等检测。结果表明，所构建文库包含＞105转化子，文库重组率＞95％，插入片断从0.4-2kb大小不等，扩增后文库滴度＞108cells／ml，可以长期低温保存。上述数据说明所构建文库基本满足了文库完整性、高重组率等方面的质量要求。初步的应用结果也表明我们所构建的文库能够广泛的应用于酵母双杂交筛选。上述这些工作不仅弥补了商品化酵母双杂交文库组织来源有限、只有AD文库缺乏BD文库等缺点，而且为HLPP计划大规模基因克隆和酵母双杂交筛选、建立肝脏蛋白相互作用图谱的研究奠定了良好基础。
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标签：细胞增殖论文; 酵母双杂交论文; 转录调控论文; 辅助激活因子论文; 人类肝脏蛋白质组计划论文; 载体改造论文; 方法论文; 文库构建论文;