多杀菌素发酵培养基优化及发酵工艺研究

论文摘要

多杀菌素是土壤放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的次级代谢产物,是一种新型生物杀虫剂,能有效防治大部分鳞翅目、直翅目、双翅目和翘翅目害虫,具有杀虫谱广,杀虫活性高,对非靶标生物安全等特点。合适的发酵条件是高效表达菌株表现高产特性的基本条件。本研究采用统计学方法对刺糖多孢菌发酵培养基成分进行优化：首先采用Plackett-Burman实验设计从葡萄糖、玉米淀粉、玉米浆、棉籽粉、豆饼粉、酵母粉、碳酸钙和油酸甲酯中筛选出葡萄糖、玉米浆和油酸甲酯是影响多杀菌素产量的显著因子,随后的最速上升实验快速将考察范围引入到多杀菌素产量最高区域,最后通过中心组合实验和响应曲面分析法对筛选的显著因子进一步优化,获得关于响应值和变量之间的二阶模型,该模型R2为94.75%,充分表明模型的有效性。通过优化获得的培养基配方为葡萄糖48.6 g/L,可溶性淀粉10 g/L,玉米浆7g/L,豆饼粉5 g/L,棉籽粉22.5 g/L,酵母粉2 g/L,碳酸钙5 g/L,油酸甲酯36 g/L,采用优化配方在20 L发酵罐进行分批发酵,产量和产率分别提高29.6%和85.1%。温度是影响发酵的重要因素,研究了温度控制在26℃-32℃刺糖多孢菌分批发酵过程动力学特征,分析了温度对菌体生长、产物合成和底物消耗的影响,较高温度条件菌体代谢速度加快,有利于缩短延滞期,但菌体提前老化造成产物合成时期缩短并最终影响产量；低温条件,菌体代谢较慢,然而多杀菌素合成期较长有利于多杀菌素的积累,在此基础上提出三阶段变温控制发酵策略：0-48 h,温度控制为30℃；48-192 h,温度控制为28℃；192-240 h再次将温度调回至30℃。最终发酵周期为240 h,多杀菌素含量达到383.6 mg/L,比32℃恒温发酵提高约147.9%；比30℃和29℃恒温发酵分别提高了12.06%和6.1%；产量略低于28℃恒温发酵,生产强度较28℃条件提高12.7%。溶解氧（DO）极大的影响好氧菌的发酵效价,初步研究了溶氧浓度分别为30%、40%和50%条件下分批发酵过程中菌体生长,底物消耗和多杀菌素合成情况,表明高溶氧水平有利于多杀菌素合成,溶氧浓度维持在50%较30%和40%条件产量分别提高了60.54%和88.5%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1. 多杀菌素的研究进展
• 1.1. 多杀菌素的发现及开发历程
• 1.2. 多杀菌素的分子结构及成分
• 1.3. 多杀菌素的物理及化学性质
• 1.4. 多杀菌素的生物合成及基因簇
• 1.5. 多杀菌素的杀虫活性及作用机理
• 1.6. 多杀菌素的非靶标毒性及选择性
• 1.7. 多杀菌素的降解途径
• 1.8. 多杀菌素高产优质菌株的选育
• 1.9. 多杀菌素发酵培养基研究
• 1.10. 多杀菌素的提取工艺
• 1.11. 多杀菌素的分析检测方法
• 2. 发酵培养基优化方法
• 2.1. 单因子实验法
• 2.2. 均匀设计法
• 2.3. 正交设计法
• 2.4. Plackett-Buman实验设计
• 2.5. 响应曲面分析法
• 3. 发酵工艺研究
• 3.1. 温度对发酵的影响
• 3.2. 溶解氧对发酵的影响
• 4. 本研究的目的和意义
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1. 试验菌株
• 1.2. 培养基和试剂
• 1.3. 主要仪器及设备
• 2. 方法
• 2.1. 种子培养
• 2.2. 发酵培养
• 2.3. 多杀菌素含量测定
• 2.4. 还原糖含量测定
• 2.5. 生物量的测定
• 2.6. 响应曲面法优化多杀菌素发酵培养基
• 结果与分析
• 1. 响应曲面法优化多杀菌素发酵培养基
• 1.1. Plackett-Buman实验筛选显著因子
• 1.2. 最速上升实验逼近多杀菌素产量最高区域
• 1.3. 响应曲面分析法优化多杀菌素发酵培养基
• 1.4. 优化配方的验证
• 2. 多杀菌素分批发酵三阶段变温控制策略
• 2.1. 不同温度多杀菌素分批发酵过程
• 2.2. 不同温度对比生长速率的影响
• 2.3. 不同温度对多杀菌素比合成速率的影响
• 2.4. 不同温度对葡萄糖比消耗速率的影响
• 2.5. 多杀菌素分批发酵三阶段变温控制策略
• 3. 溶氧水平对多杀菌素发酵的影响
• 3.1. 溶氧水平对分批发酵过程中菌体生长的影响
• 3.2. 溶氧水平对分批发酵过程中产物合成的影响
• 3.3. 溶氧水平对分批发酵过程中对底物消耗的影响
• 讨论
• 1. 响应曲面法优化多杀菌素发酵培养基
• 2. 变温控制对多杀菌素分批发酵的影响
• 3. 溶解氧对多杀菌素分批发酵的影响
• 参考文献
• 硕士期间撰写和发表的与本课题相关的学术论文
• 致谢