蒲黄总黄酮对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖代谢的影响及机制研究

论文摘要

背景2型糖尿病、代谢综合征等多种代谢性疾病已经成为严重威胁人类健康的公共卫生问题之一,其发病的中心环节和病理生理学基础是胰岛素抵抗（Insulin resistance, IR）,而IR发生的重要机制是胰岛素信号通路的障碍,因此,提高胰岛素信号通路的活性是防治IR的重要策略。除了经典的磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinosito1-3 kinase, PI3K）胰岛素信号通路外,近年,科学家发现了一条新的胰岛素信号转导通路,即β-arrestin 2依赖性信号通路。在胰岛素刺激下,β-arrestin 2能募集Src和Akt到胰岛素受体（Insulin receptor, IR）,并结合形成一信号转导复合物,从而调节胰岛素介导的葡萄糖代谢效应。新的胰岛素信号通路的发现将有助于进一步理解IR,也为防治IR相关性疾病提供了新的作用靶点。目前改善IR的代表药物是噻唑烷二酮类（Thiazolidinediones, TZD）药物,其作用机制是激动过氧化物酶增殖活化受体-Y,提高P13K信号通路的活性。尽管TZD已广泛用于IR相关性疾病的防治,但也出现了一些副作用,如引起水钠储留,增加体重和体脂,并增加2型糖尿病患者心血管事件的风险,包括致死性心血管事件的发生。因此,寻找一种既能提高胰岛素敏感性又不至于引起脂肪堆积,不增加心血管事件等不良反应的胰岛素增敏剂是目前研究的一个重要方向。近年在临床上,传统的一种活血化瘀中药——蒲黄常用于治疗伴IR的2型糖尿病、代谢综合征、肥胖等。在体外实验中,课题组前期工作发现蒲黄有效提取物蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）能增加3T3L-1脂肪细胞依赖于胰岛素的葡萄糖摄取和利用,减少脂肪细胞内脂质聚集,具有改善IR的潜在能力,但PTF缺乏系统的研究,其潜在分子机制也不清楚。目的1.观察PTF对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取的影响,并了解这种效应与胰岛素的关系；2.观察PTF对高浓度棕榈酸和高糖高胰岛素诱导的IR模型细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取的影响；3.从蛋白水平观察PTF对PI3K信号通路和β-arrestin2依赖性信号通路相关信号分子蛋白表达的影响,探讨PTF提高胰岛素敏感性的分子机制；4.从基因水平观察PTF对β-arrestin2依赖性信号通路相关信号分子基因mRNA表达的影响,进一步探讨PTF提高胰岛素敏感性的分子机制。方法1.二甲氧唑黄（XTT）比色法观察PTF对C2C12骨骼肌细胞活力的影响；2.分别采用葡萄糖氧化酶法和氚标记的脱氧葡萄糖摄取法检测C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取；3.模拟IR患者体内脂质代谢紊乱及高血糖高胰岛素水平的病理生理特点,以氚标记的脱氧葡萄糖摄取试验为标准,分别采用高浓度棕榈酸和高糖高胰岛素孵育诱导C2C12骨骼肌细胞,建立IR细胞模型；4.免疫印迹法（Western Blot）法检测PI3K信号通路和β-arrestin 2依赖性信号通路相关信号分子蛋白表达及其磷酸化水平；5.免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）法检测β-arrestin 2信号转导复合物的形成,并用Western Blot法鉴定复合物中蛋白分子；6. ELISA法检测PI3K活性；7. Real-time PCR检测基因P-arrestin 2、Src和Akt2 mRNA表达量。结果1.PTF对C2C12骨骼肌细胞活力的影响PTF干预C2C12骨骼肌细胞24小时,细胞活性与PTF浓度呈负相关。当PTF浓度在0.05-1.0g/L之间时,与对照组比较,细胞的活性无明显的改变（P>0.05）；而当PTF浓度≥1.0 g/L时,细胞的活性比对照组下降5.65%以上,差异有统计学意义（P<0.01）。2.PTF对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗的影响以不同浓度的PTF（0.1g/L,0.25g/L,0.5g/L）分别孵育C2C12骨骼肌细胞8h、16 h、24 h,PTF呈胰岛素依赖性促进了C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗。PTF干预8 h,只有0.5 g/L浓度点PTF呈胰岛素依赖性提高了细胞的葡萄糖消耗量,比胰岛素处理组升高了10.63%,差异有统计学意义（P<0.05）；PTF干预16 h,0.25g/L和0.5g/L浓度点PTF都能促进细胞在胰岛素处理下的葡萄糖消耗量,分别比胰岛素处理组升高了10.62%和17.50%,差异明显（P<0.05和P<0.01）；而干预24 h,3个浓度点PTF干预的细胞葡萄糖消耗量分别比胰岛素处理组提高了11.60%,12.78%和16.23%,差异显著（P<0.05、P<0.01和P<0.01）。3.PTF对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响以不同浓度的PTF（0.1 g/L,0.25 g/L,0.5 g/L）分别孵育C2C12骨骼肌细胞8h、16h、24h, PTF呈胰岛素依赖性促进了C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取。PTF干预8 h,只有0.5g/L浓度点PTF呈胰岛素依赖性提高了细胞的葡萄糖摄取量,比胰岛素处理组升高了14.79%,有统计学意义（P<0.05）；PTF干预16 h,0.25g/L和0.25 g/L浓度点PTF都能促进细胞在胰岛素处理下的葡萄糖摄取量,分别比胰岛素处理组升高了20.52%和34.84%,差异显著（P<0.01和P<0.01）；而PTF干预24 h,3个浓度点PTF干预的细胞葡萄糖摄取量分别比胰岛素处理组提高了12.29%,23.40%和30.31%,差异明显（P<0.05、P<0.01和P<0.01）。4. Wortmannin及PP2对PTF促进C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响与胰岛素处理组相比,5 uM PI3K特异性抑制剂wortmannin干预C2C12骨骼肌细胞16 h,能明显抑制胰岛素处理下细胞的葡萄糖摄取量（P<0.01）,但不能抑制PTF呈胰岛素依赖性促进细胞对葡萄糖的摄取（P>0.05）；而5 uM Src特异性阻断剂PP2干预C2C12骨骼肌细胞16 h,也能显著抑制胰岛素处理下细胞的葡萄糖摄取量（P<0.01）,同时也明显抑制PTF呈胰岛素依赖性促进细胞对葡萄糖的摄取（P<0.01）。5.IR细胞模型的建立与正常胰岛素处理组比较,以0.5 mM棕榈酸孵育C2C12骨骼肌细胞16 h,细胞对依赖于胰岛素的葡萄糖消耗量和葡萄糖摄取量分明别下降了19.29%和22.22%,差异明显（P<0.01和P<0.01）；而以高糖（25 mM）高胰岛素（1μM）孵育C2C12骨骼肌细胞16 h,细胞对依赖于胰岛素的葡萄糖摄取量明显低于低糖（5mM）低胰岛素（1 nM）组（P<0.01）。6.PTF对IR模型细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取的影响以0.5 g/L PTF和棕榈酸共同孵育C2C12骨骼肌细胞16 h,与棕榈酸诱导的IR细胞相比,该细胞对依赖于胰岛素的葡萄糖消耗量和葡萄糖摄取量均得以显著提高（P<0.01和P<0.01）,与正常胰岛素处理组相类似（P>0.05）；同样,0.5 g/LPTF与高糖高胰岛素共同孵育C2C12骨骼肌细胞16 h,几乎可以逆转由高糖高胰岛素所诱导的葡萄糖摄取量下降（P<0.01）。7.PTF对胰岛素信号通路相关信号分子蛋白表达的影响PTF干预C2C12骨骼肌细胞16 h,能显著提高细胞β-arrestin2、Src和Akt的蛋白表达,分别是对照组的1.65倍（P<0.01）、1.72倍（P<0.01）和1.24倍（P<0.05）,胰岛素处理组的1.66倍（P<0.01）、1.67倍（P<0.01）和1.49倍（P<0.01）；PTF干预C2C12骨骼肌细胞16 h,与胰岛素处理组相比较,PTF能显著提高胰岛素刺激下InsRβ（Tyrl 150/1151）、Src（Tyr416）、Akt(Thr308及Akt （Ser473）磷酸化水平（P<0.01）；在胰岛素刺激下,β-arrestin 2募集Src、Akt并结合InsR形成一信号转导复合物；PTF预先干预C2C12骨骼肌细胞16 h,能显著促进该信号复合物的形成；PTF干预C2C12骨骼肌细胞16 h,细胞PI3K-p85蛋白表达和P13K活性分别是对照组的1.02倍和1.07倍,胰岛素处理组的1.10倍和1.03倍,均无统计学意义（P>0.05）。8. Wortmannin及PP2对PTF提高Akt磷酸化水平的影响wortmannin干预C2C12骨骼肌细胞16 h,能显著抑制Akt（Thr308）和Akt（Ser473）磷酸化水平,分别比胰岛素处理组下降55.95%（P<0.01）和44.56%（P<0.01）；但PTF依赖于胰岛素提高Akt（Thr308/Ser473）磷酸化水平的效应不被wortmannin所抑制（P>0.05）；同样,PP2干预C2C12骨骼肌细胞16 h,也能显著抑制Akt（Thr308）和Akt（Ser473）磷酸化水平,分别比胰岛素处理组下降51.18%（P<0.01）和46.83%（P<0.01）；而PTF依赖于胰岛素提高Akt（Thr308）和Akt（Ser473）磷酸化水平的效应也被PP2所抑制,分别下降65.74%（P<0.01）和66.06%（P<0.01）。9.PTF对胰岛素信号通路相关信号分子基因表达的影响PTF孵育C2C12骨骼肌细胞16 h,能明显提高基因Src和Akt2 mRNA的表达,分别是对照组的1.18倍（P<0.05）和1.26倍（P<0.01）,但PTF对基因P-arrestin 2 mRNA的表达无明显影响（P>0.05）。结论1.PTF在不降低细胞活力的情况下,呈胰岛素依赖性提高C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取。2.PTF呈胰岛素依赖性促进C2C 12骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取受Src阻断剂PP2所抑制而不受PI3K抑制剂wortmannin所抑制。3.高浓度棕榈酸和高糖高胰岛素都可以诱导C2C12骨骼肌细胞产生IR。4.PTF能够逆转分别由棕榈酸、高糖高胰岛素诱导C2C12骨骼肌细胞所产生的IR。5.PTF提高了C2C12骨骼肌细胞基因Src和Akt2 mRNA的表达及β-arrestin2、Src和Akt蛋白表达。6.PTF呈胰岛素依赖性提高InsRβ（Tyrl 150/1151）、Src（Tyr416）及Akt （Thr308/Ser473）磷酸化水平,并促进β-arrestin 2募集Src和Akt并结合InsR形成信号转导复合物。7.PTF提高Akt（Thr308/Ser473）磷酸化水平受PP2而不受wortmannin所抑制。8.PTF对P13K-p85蛋白表达和P13K活性无影响。总之,PTF可能是通过增强P-arrestin 2依赖性信号通路的活性而呈胰岛素依赖性提高C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取。

论文目录

• 缩略语对照表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 蒲黄总黄酮对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖代谢的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 蒲黄总黄酮对棕榈酸诱导及高糖高胰岛素诱导C2C12骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 蒲黄总黄酮对胰岛素信号通路相关信号分子蛋白表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 蒲黄总黄酮对胰岛素信号通路相关信号分子基因mRNA表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 研究结论
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 附录