靶向沉默MT1-MMP基因对血管平滑肌细胞迁移能力的影响

论文摘要

第一部分大鼠MT1-MMP短发卡RNA表达载体的构建及鉴定目的：构建靶向大鼠膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）的短发卡RNA（shRNA）真核表达载体质粒，为利用RNA干扰技术抑制大鼠血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的研究做准备。方法：根据大鼠MT1-MMP mRNA序列（NM031056）设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1，并进行酶切鉴定和测序。结果：酶切证明构建的shRNA已插入载体，经测序证明与设计的相同。结论：成功构建了大鼠真核表达质粒重组体（pGenesil-1-MT1-MMP），为进一步靶向大鼠血管平滑肌细胞MT1-MMP行RNA干扰的实验研究奠定了基础。第二部分大鼠血管平滑肌细胞的培养与鉴定目的：建立一种大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养方法，为下一步的研究提供实验材料。方法：采用组织贴块法、胰酶消化法进行细胞原代及传代培养，综合运用自然纯化、机械刮除、差异贴壁法进行细胞纯化，并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果：90％的组织块接种存活，第5代的平滑肌细胞纯度达98％以上。相差显微镜下培养细胞呈典型的“峰-谷状”生长，免疫细胞化学染色显示特异的α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论：本法简便、可靠，培养的平滑肌细胞纯度高、性能好。可作为研究移植血管再狭窄良好的体外模型。第三部分靶向沉默MT1-MMP对血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的影响目的：探讨pGenesil-1-MT1-MMP对大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）MT1-MMP基因mRNA表达及蛋白表达的影响。方法：实验分为三组，空白对照组，阴性对照组（加入pGenesil-1-HK），RNAi组（加入pGenesil-1-MT1-MMP）。用脂质体瞬时转染VSMC 48h后通过流式细胞仪检测转染效率，于转染后72 h采用RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA水平，用Western blot方法检测MT1-MMP蛋白质水平。结果：瞬时转染VSMC 48h后通过流式细胞仪检测转染效率高达85．5％，转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒72 h后，实验组MT1-MMP mRNA及蛋白质水平明显下调（P＜0．05）。结论：靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够高效地转染入VSMC，并能有效下调MT1-MMP基因mRNA及其蛋白的表达。第四部分靶向沉默MT1-MMP基因对血管平滑肌细胞迁移能力的影响目的：探讨靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒（pGenesil-1-MT1-MMP）对大鼠VSMC体外迁移能力的影响。方法：实验分为三组，空白对照组，阴性对照组（加入pGenesil-1-HK），RNAi组（加入pGenesil-1-MT1-MMP）。用脂质体瞬时转染VSMC，用Transwell侵袭小室模型和细胞划痕试验检测细胞体外迁移能力的变化，通过MTT法测定细胞增殖能力，用Annexin V-FITC法检测细胞凋亡情况。结果：转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒后，VSMC的体外迁移能力明显减弱（P＜0．05），细胞增殖活性及细胞凋亡无明显改变。结论：靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够降低VSMC体外迁移能力。

论文目录

• 缩写词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 绪言
• 研究报告
• 第一部分 大鼠MT1-MMP短发卡RNA表达载体的构建及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 大鼠血管平滑肌细胞的培养与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 靶向沉默MT1-MMP对血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 靶向沉默MT1-MMP基因对血管平滑肌细胞迁移能力的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 总结与展望
• 综述
• 附录
• 致谢