联合应用携hIFNγ基因与携hIGF-1基因的成肌细胞治疗小鼠骨骼肌损伤

论文摘要

在已经证实外源性hIGF-1和携hIGF-1基因成肌细胞可以促进损伤骨骼肌再生和一定程度抑制损伤骨骼肌纤维化的研究基础上,本课题重点研究hIFNγ对损伤骨骼肌发生纤维化的影响。本研究第一部分首先证实外源性hIFNγ可以明显抑制损伤骨骼肌纤维化,与外源性hIGF-1联合应用能够促进损伤骨骼肌修复。第二部分采用基因治疗的手段重组hIFNγ基因,并转染至成肌细胞,经体外实验证实该基因编码的产物能在胞内稳定表达并具有生物活性。第三部分将转hIFNγ基因的成肌细胞和转hIGF-1基因的成肌细胞联合移植到损伤骨骼肌,观察其在损伤骨骼肌微环境下的存活,以及两种基因是否能在骨骼肌内分别表达,第四部分探讨了联合移植携hIGF-1基因和携hIFNγ成肌细胞对损伤骨骼肌的修复。第一部分联合应用外源性hIFNγ和hIGF-1治疗小鼠骨骼肌急性钝挫伤目的:观察小鼠骨骼肌急性钝挫伤后,单独或联合注射外源性hIFNγ和hIGF-1对骨骼肌修复过程中再生和纤维化的影响。方法:64只7～12周雄性C3H小鼠,制作右侧腓肠肌钝挫伤动物模型,随机分成4组,即A组（注射hIFNγ）、B组（注射hIGF-1）、C组（联合注射hIFNγ和hIGF-1）、D组（注射生理盐水）。挫伤后第10d,各组小鼠在腓肠肌损伤处分别注射不同药物进行干预。分别于干预前（伤后7d）和干预后4d、18d、32d（伤后14d、28d、42d）从各组中随机抽取4只小鼠取腓肠肌损伤部位肌肉,用荧光定量PCR和免疫荧光化学检测不同时间点Ⅱb型肌球蛋白重链（Myosin heavychain-Ⅱb,MHC-Ⅱb）及波形蛋白（Vimentin）的表达。统计学分析使用SPSS 10.0统计软件,采取One-Way ANOVA方法进行检验,p＜0.05具有统计学意义。结果:（1）干预后各时间点,B、C组小鼠损伤骨骼肌MHC-Ⅱb表达水平（包括mRNA与蛋白）较A、D组明显升高;（2）干预后各时间点A、B、C组小鼠损伤骨骼肌Vimentin表达（包括mRNA与蛋白）较D组降低,其中以A组和B组降低更明显。结论:（1）在骨骼肌急性损伤后,局部注射hIGF-1有明显促进骨骼肌再生和一定程度抑制纤维化的作用;（2）局部注射hIFNγ仅表现出抑制纤维化的作用,其作用远比hIGF-1明显;（3）联合应用hIGF-1和hIFNγ,能够同时促进骨骼肌再生和抑制纤维化,有效地促进了损伤骨骼肌的愈合。第二部分hIFNγ真核表达质粒的构建及转染后在成肌细胞内的表达与活性鉴定目的:构建携带hIFNγ目的基因的真核表达重组质粒pEGFP-C2-hIFNγ,将其转染至小鼠C2C12成肌细胞后,观察hIFNγ基因在细胞内的表达,以及该基因编码产物hIFNγ蛋白的生物活性。方法:（1）应用基因重组技术,将hIFNγ基因克隆到pEGFP-C2真核表达载体中,以酶切和测序方法鉴定重组质粒pEGFP-C2-hIFNγ的正确性;（2）经脂质体介导将pEGFP-C2-hIFNγ转染至C2C12成肌细胞,24h后,在荧光倒置显微镜下观察增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescentp rotein,EGFP）瞬时表达情况;（3）通过G418进行梯度筛选,获得能够稳定表达hIFNγ的细胞克隆,用RT-PCR和Western Blot法检测转染细胞hIFNγ的表达;（4）以TGFβ-1处理WI-38成纤维细胞,再与转hIFNγ基因的成肌细胞或空白成肌细胞共培养,以荧光定量PCR和免疫荧光化学方法检测α-SMA的表达。结果:（1）酶切和测序结果均证实正确构建了hIFNγ真核表达质粒pEGFP-C2-hIFNγ;（2）细胞转染pEGFP-C2-hIFNγ后24h,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达,40%以上细胞发出绿色荧光;（3）RT-PCR和Western Blot检测到转染细胞中有明显的hIFNγmRNA和蛋白表达;（4）转hIFNγ基因的成肌细胞能够抑制经TGFβ-1处理的WI-38细胞表达α-SMA。结论:（1）成功制备了含hIFNγ基因的真核表达质粒,并成功转染至小鼠C2C12成肌细胞;（2）转hIFNγ基因的C2C12成肌细胞能够稳定表达有活性的hIFNγ。第三部分联合移植携hIFNγ基因和携hIGF-1基因的成肌细胞在小鼠损伤骨骼肌的存活及基因产物的表达目的:观察联合移植携hIFNγ基因和携hIGF-1基因的成肌细胞,在小鼠损伤骨骼肌的存活以及重组MFNγ基因和重组hIGF-1基因产物的表达方法:64只7～12周雄性C3H小鼠,除4只小鼠作正常对照外,60只小鼠被制作右侧腓肠肌钝挫伤动物模型,随机分成5组,即A组（注射转hIFNγ基因的C2C12细胞）,B组（注射转MGF-1基因的C2C12细胞）,C组（联合注射转hIFNγ基因的和转hIGF-1基因的C2C12细胞）,D组（注射空白C2C12成肌细胞）,E组（注射生理盐水）。挫伤后第10d,各组小鼠于腓肠肌损伤局部注射不同药物。伤后14d、28d、42d,于各组中随机抽取4只小鼠取右侧腓肠肌损伤部位肌肉,行BrdU免疫荧光化学染色,检测外源细胞在体内的存活情况;行荧光定量PCR和免疫荧光化学检测hIFNβ和hIGF-1在损伤骨骼肌局部的表达。实验结果使用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析,以P＜0.05为有统计学意义。结果:（1）细胞移植后4d-32d,A、B、C、D小鼠均有BrdU免疫组化阳性染色,四组间无明显差异;（2）只有A、C两组出现hIFNγmRNA和蛋白表达,两组间无明显差异;（3）只有B、C两组出现hIGF-1 mRNA和蛋白表达,两组间无明显差异。结论:（1）转基因成肌细胞和空白成肌细胞移植后,在损伤骨骼肌局部均能存活一定时间,重组基因对细胞的存活能力没有影响;（2）携hIFNγ基因的成肌细胞和携hIGF-1基因的成肌细胞移植后,在损伤骨骼肌局部可以分别表达hIFNγ和hIGF-1;（3）联合注射携hIFNγ基因和携hIGF-1基因的成肌细胞,在存活能力和产物表达上,相互之间无明显影响。第四部分联合应用携hIFNγ基因和携hIGF-1基因的成肌细胞治疗小鼠骨骼肌急性钝挫伤目的:观察损伤骨骼肌局部联合注射携hIFNγ基因和携hIGF-1的成肌细胞,对小鼠急性钝挫伤骨骼肌修复的影响。方法:80只7～12周雄性C3H小鼠,制作右侧腓肠肌钝挫伤动物模型,随机分成5组,即A组（注射转hIFNγ基因的C2C12细胞）,B组（注射转hIGF-1基因的C2C12细胞）,C组（联合注射转hIFNγ基因的和转hIGF-1基因的C2C12细胞）,D组（注射空白C2C12成肌细胞）,E组（注射生理盐水）。挫伤后第10d,各组小鼠于腓肠肌损伤局部注射不同药物。伤后7d、14d、28d、42d,于各组中随机抽取4只小鼠取右侧损伤腓肠肌,以荧光定量PCR和免疫荧光化学检测不同时间点波形蛋白（Vimentin）、α-SMA及MHC-Ⅱb的表达。结果:（1）干预后各时间点,A组、C组小鼠损伤骨骼肌局部的Vimentin表达较B、D、E各组降低;伤后28d、42d,B组损伤骨骼肌Vimentin表达低于D、E组;A、C组间或D、E组间Vimentin表达无明显差异;（2）干预后各时间点,A组、C组小鼠损伤骨骼肌局部的α-SMA表达较B、D、E各组降低;伤后28d、42d,B组损伤骨骼肌α-SMA表达低于D、E组;A、C组间或D、E组间α-SMA表达无明显差异;（3）干预后各时间点,B组、C组小鼠损伤骨骼肌局部的MHC-Ⅱb表达较B、D、E各组增高;B、C组间或A、D、E组间MHC-Ⅱb表达无明显差异。结论:（1）注射转hIFNγ基因的C2C12成肌细胞,可以抑制损伤骨骼肌Vimentin和α-SMA的表达,提示有抑制损伤骨骼肌纤维化的作用;（2）注射转hIGF-1基因的C2C12成肌细胞,可以使损伤骨骼肌MHC-Ⅱb表达增高,但Vimentin和α-SMA的表达轻度下降,具有促进损伤骨骼肌再生和一定程度的抑制损伤骨骼肌纤维化的作用;（3）联合注射转hIFNγ基因的C2C12成肌细胞和转hIGF-1基因成肌细胞可以使损伤骨骼肌MHC-Ⅱb表达增高和Vimentin和α-SMA的表达下降,具有同时促进骨骼肌再生和抑制损伤骨骼肌纤维化的作用。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 论文正文
• 第一部分 联合应用外源性人γ干扰素和人胰岛素样生长因子-1治疗小鼠骨骼肌急性钝挫伤
• 一 实验材料及方法
• 二 实验结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 第二部分 人γ干扰素真核表达质粒的构建及转染后在成肌细胞内的表达与活性鉴定
• 一 实验材料及方法
• 二 实验结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 第三部分 联合移植携人γ干扰素基因和携人胰岛素样生长因子-1基因的成肌细胞在小鼠损伤骨骼肌的存活及产物表达
• 一 实验材料及方法
• 二 实验结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 第四部分 联合应用携人γ干扰素基因和携人胰岛素样生长因子-1基因的成肌细胞治疗小鼠骨骼肌急性钝挫伤
• 一 实验材料及方法
• 二 实验结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述:骨骼肌损伤修复的研究进展
• 后记
• 附录