三磷酸肌醇的制备及其生物活性的研究

论文题目: 三磷酸肌醇的制备及其生物活性的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 农产品加工及贮藏工程

作者: 江洪

导师: 吴谋成

关键词: 植酸,植酸酶,土曲霉植酸酶,小麦麸皮植酸酶,微波辐射,三磷酸肌醇,抗氧化,糖尿病,抑制肿瘤,人肝癌细胞株

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本文以植酸为原料,采用酶法和非酶法水解植酸制备了具有生理活性的三磷酸肌醇。研究了不同来源的植酸酶的酶学性质,植酸的水解条件,三磷酸肌醇分离纯化方法,不同方法制备的三磷酸肌醇的结构,并对三磷酸肌醇体内外抗氧化,体内对S180肿瘤生长的抑制作用和对荷瘤小鼠免疫能力的影响,体外对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用及其对糖尿病小鼠的治疗作用进行了研究。主要结果如下: 1 土曲霉植酸酶与小麦麸皮植酸酶酶学性质的研究 通过钼锑抗法测无机磷,并以此为基础建立了植酸酶酶活测定方法。 土曲霉植酸酶反应最适条件为pH5.10,温度50℃,底物浓度为5mmol/L。钙、镁离子对该酶有激活作用,而无机磷对酶活有抑制作用,10mmol/L的无机磷对该酶的抑制作用为27%。土曲霉植酸酶的米氏常数Km为0.0528mmol/L。土曲霉植酸酶酶活达1.48*105U/g。 小麦麸皮植酸酶反应最适条件为pH5.15,温度37℃,底物浓度为2.5mmol/L,钙、镁离子对该酶有激活作用,而无机磷对酶活有抑制作用,当磷酸根离子浓度达到10mmol/L时,酶活有24%被抑制。小麦麸皮植酸酶的米氏常数Km为0.266mmol/L,酶活为1.8U/g麸皮。从麸皮中提取植酸酶时,最佳提取条件为麸皮与水的质量比为1:6,提取温度为5℃,时间为2h。小麦麸皮植酸酶在储存时应在低温进行,37℃放置16h后,酶活只有刚透析出来的酶的酶活的83.2%。 2 三磷酸肌醇的制备与分离 植酸在小麦麸皮植酸酶最适水解条件下水解,当水解度达到50%时,水解混和液上717型强离子交换树脂,0.05～0.7M盐酸梯度洗脱,洗脱物分别取样消化,检测无机磷含量变化,并将同一峰值部分收集在一起,用NaOH中和,加CaCl2溶液,产生沉淀,过滤,沉淀用HCl溶解,上732型阳离子树脂脱去钙离子,蒸馏水洗脱,洗脱液用NaOH中和至中性后,减压浓缩,冷冻干燥制得InsP3。用HPLC方法证明InsP3中无其他低磷酸肌醇,收率为28.4%。所得InsP3进一步用阴离子交换树脂分离,得到了两个InsP3组分。 植酸经土曲霉植酸酶水解,水解产物经同样方法处理,当水解度为50%,收率为26%。所得InsP3进一步用阴离子交换树脂分离,得到两个InsP3组分。 用微波辐射方法水解植酸,当水解度为50%,InsP3收率为18.4%。 由小麦麸皮植酸酶、土曲霉植酸酶、微波辐射方法制得的InsP3分别被命名为InsP3A、InsP3B、InsP3C。 3 三磷酸肌醇的结构分析

论文目录:

摘要

ABSTRACT

缩略语表

第一章 前言

1 磷酸肌醇酯化学

1.1 命名

1.2 分析方法

2 植酸的降解及各种低磷酸肌醇的生成

3 磷酸肌醇酯的代谢途径

3.1 磷酸肌醇酯的一般代谢途径

3.2 肌醇磷脂的PI3-激酶代谢途径

4 各种磷酸肌醇酯的生理功能及在医学上的应用

4.1 肌醇

4.2.植酸

4.2.1 抗肿瘤活性

4.2.2 植酸的抗血小板聚集活性

4.2.3 植酸的抗氧化活性

4.2.4 植酸的降血脂功能

4.2.5 植酸防治肾结石及尿道结石

4.3 Ins(1，4，5)P3类

4.4 Ins(1，2，3)P3

4.5 Ins(1，2，6)P3

4.5.1 消炎功能

4.5.2 治疗糖尿病及其综合症

4.5.3 治疗高血压

4.5.4 止痛作用

4.5.5 抗氧化

4.5.6 消除药物的副作用

4.5.7 预防和治疗人或其它动物的组织损伤

4.5.8 治疗骨科病

4.5.9 其它

4.6 Ins(1，3，4，5)P4

4.7 Ins(3，4，5，6)P4

4.8 Ins(1，3，4，5，6)P5

4.9 InsP7与InsP8

5.课题设计及意义

参考文献

第二章 植酸酶酶学性质研究

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂：

1.1.1 实验材料

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.2 研究方法

1.2.1 无机磷分析

1.2.2 酶活测定

2 结果与分析

2.1 磷的标准工作曲线

2.2 土曲霉植酸酶酶学性质

2.2.1 土曲霉植酸酶酶活力

2.2.2 pH值对土曲霉植酸酶酶活影响

2.2.3 温度对土曲霉植酸酶酶活力的影响

2.2.4 底物浓度对土曲霉植酸酶酶活力的影响

2.2.5 无机离子对土曲霉植酸酶酶活力的影响

2.2.6 土曲霉植酸酶酶动力学研究

2.3 影响小麦麸皮植酸酶酶活性参数

2.3.1 料液比对麸皮植酸酶提取效果的影响

2.3.2 麸皮浸泡时间与酶活关系

2.3.3 透析后酶存放条件与酶活的关系

2.3.4 pH值对小麦麸皮植酸酶酶活影响

2.3.5 温度对小麦麸皮植酸酶酶活力的影响

2.3.6 无机离子对小麦麸皮植酸酶酶活力的影响

2.3.7 底物浓度对小麦麸皮植酸酶酶活力的影响

2.3.8 小麦麸皮植酸酶酶动力学研究

3 结论

4 讨论

4.1 pH值和温度与酶活关系

4.2 底物浓度与酶活关系

4.3 钙离子与酶活性

4.4 酶催化反应速度与磷酸根离子及Km的关系

4.5 小麦麸皮植酸酶提取条件与保存条件

参考文献

第三章 三磷酸肌醇的制备与分离

1 材料与方法

1.1 实验主要材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 研究方法

1.4.1 无机磷分析

1.4.2 洗脱液中有机磷含量分析

1.4.3 低磷酸肌醇的HPLC分析方法

1.4.4 紫外光谱分析方法测磷酸肌醇的含量

1.4.5 植酸钠水解程度分析

1.4.6 三磷酸肌醇制备方法

1.4.7 三磷酸肌醇分离纯化方法

1.4.8 三磷酸肌醇异构体进一步分离纯化

2 结果与分析

2.1 小麦麸皮植酸酶水解植酸制备三磷酸肌醇

2.1.1 小麦麸皮植酸酶水解植酸制各三磷酸肌醇洗脱曲线图

2.1.2 小麦麸皮植酸酶水解植酸制备三磷酸肌醇HPLC分析

2.1.3 紫外吸收光谱法对InsP3定量分析方法的确立

2.1.4 三磷酸肌醇异构体的进一步分离

2.2 采用土曲霉植酸酶水解植酸制备三磷酸肌醇的分离与纯化

2.2.1 土曲霉植酸酶水解植酸制备三磷酸肌醇洗脱曲线图

2.2.2 用土曲霉植酸酶制得的三磷酸肌醇异构体的进一步分离

2.3 微波辐射水解植酸制备三磷酸肌醇

2.3.1 微波辐射水解植酸制备三磷酸肌醇洗脱曲线图

2.3.2 pH值对植酸化学水解时影响的研究

3 结论

4 讨论

4.1 植酸水解工艺的探讨

4.2 植酸水解产物分离时检测方法的选择

4.3 洗脱时洗脱剂的选择

4.4 化学水解机理探讨

参考文献

第四章 三磷酸肌醇的结构分析

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂：

1.2 主要仪器

1.3 研究方法

2 结果与分析

2.1 三磷酸肌醇的质谱解释

2.1.1 Ins(1，2，6)P3的质谱图解释

2.1.2 Ins(1，2，3)P3的质谱图解释

2.2 三磷酸肌醇的~1HNMR解释

2.2.1 用小麦麸皮植酸酶制得的三磷酸肌醇的~1HNMR

2.2.2 用土曲霉植酸酶制得的三磷酸肌醇的~1HNMR

2.3 三磷酸肌醇红外光谱分析

2.3.1 由微波辐射方法制得的三磷酸肌醇的红外光谱图

2.3.2 Ins(1，2，3)P3的红外光谱图

2.3.3 Ins(1，2，6)P3的红外光谱图

3 结论

4 讨论

4.1 小麦麸皮植酸酶水解植酸途径的探讨

4.2 土曲霉植酸酶水解植酸途径的探讨

4.3 关于元素分析问题

参考文献

第五章 三磷酸肌醇抗氧化性的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.2 试验方法

1.2.1 InsP3还原能力的测定

1.2.2 化学模拟体系中InsP3抗活性氧能力的测定

1.2.3 InsP3对小鼠血清抗活性氧能力影响的研究

1.2.4 对小鼠肝匀浆MDA生成的影响

1.2.5 InsP3在小鼠体内的抗氧化作用

1.2.6 对红细胞自氧化溶血的影响

1.2.7 抗油脂氧化性的研究

1.2.8 统计学分析

2.结果与分析

2.1 InsP3还原能力的测定

2.2 化学模拟体系中InsP3抗活性氧能力的测定

2.3 InsP3对小鼠血清抗活性氧能力影响

2.4 InsP3对小鼠肝匀浆MDA生成的影响

2.5 InsP3在小鼠体内的抗氧化作用

2.6 InsP3对红细胞自氧化溶血的影响

2.7 抗油脂氧化性

3 小结

4 讨论

4.1 三磷酸肌醇体外抗氧化机理的探讨

4.2 三磷酸肌醇生物体系中抗氧化机理的探讨

参考文献

第六章 三磷酸肌醇对四氧嘧啶型糖尿病小鼠的治疗作用研究

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立

1.2.2 三磷酸肌醇对正常小鼠血糖及免疫器官的影响

1.2.3 三磷酸肌醇对四氧嘧啶糖尿病小鼠的治疗实验

1.2.4 统计学分析

2.结果与分析

2.1 三磷酸肌醇对正常小鼠血糖的影响

2.2 三磷酸肌醇对小鼠免疫器官的影响

2.2.1 三磷酸肌醇对正常小鼠免疫器官的影响

2.2.2 三磷酸肌醇对四氧嘧啶糖尿病小鼠免疫器官的影响

2.2 三磷酸肌醇对四氧嘧啶糖尿病小鼠的治疗作用

2.2.1 三磷酸肌醇对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用

2.2.2 组织病理学观察

3 结论

4 讨论

4.1 三磷酸肌醇降血糖机理

4.2 三磷酸肌醇提高免疫力与降血糖关系

参考文献

第七章 三磷酸肌醇抑制小鼠体内S_(180)肿瘤活性的研究

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.2.实验方法

1.2.1 接种方法

1.2.2 施药方法

1.2.3 肿瘤抑制实验

1.2.4 过氧化氢酶(CAT)的活力测定

1.2.5 迟发型超敏反应(DTH)

1.2.6 血清溶血素含量测定

1.2.7 脾细胞抗体形成

1.2.8 组织切片病理学观察

1.2.9 统计方法

2.实验结果与分析

2.1 三磷酸肌醇对荷S_(180)瘤小鼠的抑瘤作用

2.2 三磷酸肌醇对荷S_(180)瘤小鼠免疫器官的影响

2.3 三磷酸肌醇对荷S_(180)瘤小鼠红细胞过氧化氢酶活力的影响

2.4 三磷酸肌醇对荷S_(180)小鼠迟发型超敏反应的影响

2.5 三磷酸肌醇对荷S_(180)小鼠血清溶血素含量的影响

2.6 三磷酸肌醇对荷S_(180)瘤小鼠脾细胞抗体的影响

2.7 肿瘤组织病理学观察

3.小结

4.讨论

4.1 三磷酸肌醇抗癌可能机理

4.2 三磷酸肌醇抗癌与磷酸肌醇代谢

参考文献

第8章 三磷酸肌醇对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 主要试剂与药品

1.3 主要仪器

1.4 试验方法

1.4.1 细胞培养

1.4.2 台盼蓝染色观察细胞活力

1.4.3 MTT法检测InsP3对SMMC-7721细胞的生长抑制作用

1.4.4 InsP3对SMMC-7721细胞形态的影响

1.4.5 流式细胞术观察InsP3对SMMC-7721细胞周期的影响

1.4.6 InsP3对SMMC-7721细胞甲胎球蛋白(AFP)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响

2 结果与分析

2.1 InsP3对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

2.2 InsP3对SMMC-7721细胞形态的影响

2.3 三磷酸肌醇对SMMC-7721细胞周期的影响

2.4 三磷酸肌醇对SMMC-7721细胞甲胎球(AFP)蛋白及细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响

2.4.1 对SMMC-7721细胞甲胎球(AFP)蛋白表达的影响

2.4.2 对SMMC-7721细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响

3 结论

4 讨论

4.1 三磷酸肌醇抑制肿瘤细胞生长对植酸抑瘤活性的启示

4.2 磷酸肌醇抗癌与细胞周期改变

4.3 细胞分化与磷酸肌醇抗肿瘤活性

参考文献

第九章 结论

致谢

附录 博士期间发表文章

发布时间: 2005-12-05

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