论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）,即老年性痴呆,属于最常见的一种痴呆类型,是发生于老年期或老年前期的原发性、不可逆性的神经退行性疾病。AD的临床表现以进行性学习、记忆和认知功能障碍为特征,其典型的病理特征包括脑内出现大量的老年斑（senileplaques,SP）和神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）。随着世界人口平均年龄的增长和社会老龄化程度的加剧,AD发病率不断升高,预计未来五十年AD的患病率还将增加四倍。AD目前已被公认为是导致老年人死亡的第四大杀手,但目前为止仍缺乏有效的治疗方法。因此,对AD发病过程中有关分子机制的深入探讨毫无疑问将对最终战胜AD提供非常有价值的帮助。载脂蛋白E（apolipoprotein E,apoE）是一种广泛分布于人体、具有多种生物学特性的蛋白质分子,除肝脏外,脑是其第二大表达器官。而且,载脂蛋白E是在脑脊液中发现的仅有的两种载脂蛋白中的一种（另一种是apoA-1）。载脂蛋白E在中枢神经系统中对神经发育、再生、修复以及学习记忆等生理过程都有重要作用。在人类,载脂蛋白E有三种主要的异构体（即apoE2,apoE3,和apoE4）,分别由位于19号染色体上的三个等位基因（ε2,ε3,和ε4）编码。流行病学调查显示,随着ε4等位基因出现频率的增加,AD发病的可能性大大增加,发病年龄也有所提前。因此,APOEε4作为迟发家族性AD和散发性AD的易感基因已被人们广泛接受。同时,APOEε4的表达产物载脂蛋白E4也存在于AD特征性病理标志SP和NFT中,说明载脂蛋白E4参与了AD的病理过程。然而,载脂蛋白E4对脑内各种神经活动的影响,特别是对能够反映早期学习和记忆功能的电生理指标的影响及其机制至今还远未被阐明。长时程增强（long-term potentiation,LTP）是由高频刺激（high-frequency stimulation,HFS）引发的一种兴奋性突触传递效能长时间持续增强的现象。鉴于海马是AD发病过程中最早和最易受累的脑区之一,海马LTP损害与动物认知缺损高度相关,海马LTP已被作为一个学习记忆的电生理细胞模型用于AD发病机制研究。虽然已知载脂蛋白E与认知缺损和AD发病密切相关,但已有的关于载脂蛋白E各种亚型对海马LTP作用的研究结果互有矛盾,有些实验表明载脂蛋白E对LTP具有有益的作用,而另一些实验则显示了载脂蛋白E的有害影响。特别是,不同载脂蛋白E亚型对在体海马LTP作用的研究尚未见报道,载脂蛋白E对海马LTP影响的潜在机制也不清楚。越来越多的科学证据提示谷氨酸受体介导的兴奋性神经毒参与了AD的发病。其中,NMDA受体由于其对钙离子的高通透性使其在参与突触可塑性如LTP的形成中具有重要意义;但同时NMDA受体过度激活形成的钙超载也是诱发神经毒性作用的重要环节。分子生物学及配体结合同位素显像技术已经证明,AD病人中NMDA受体表达水平明显下降,然而相反的现象是NMDA受体功能在AD发病过程中却病理性地被过度激活了。NMDA受体功能过度激活的原因尚不清楚,载脂蛋白E是否在NMDA受体的过度激活中发挥重要作用?采用分离或培养的神经细胞观察载脂蛋白E对NMDA受体介导的电流是否具有直接影响可能是解决这一问题的一个重要手段。作为NMDA受体过度激活的结果,细胞内钙离子浓度的增高成为一个重要的引发细胞内信号转导的事件,同时也是一个可供检测NMDA受体功能活动的指标。一系列证据表明胞内钙稳态紊乱是AD发病过程中的最早的分子事件之一,支持了最早由Khachaturian提出的假说,即胞内钙信号的持续性失调对于AD的发病机制至关重要。与AD发病密切相关的载脂蛋白E4是否能够经由NMDA受体途径引起细胞内钙离了浓度持续增高从而影响神经元钙稳态,有望通过细胞内钙离子荧光成像技术进一步澄清。鉴于以上分析,本研究的主要目的在于:（1）利用场电位记录技术探讨不同亚型的载脂蛋白E（apoE4和apoE3）对大鼠在体海马LTP的调制作用,并阐明其可能的作用途径;（2）利用膜片钳技术观察不同亚型的载脂蛋白E对NMDA受体介导的全细胞电流的直接效应,以证实NMDA受体是否是载脂蛋白E发挥神经毒性作用的一个重要靶点;（3）采用细胞内钙成像技术证实载脂蛋白E是否影响细胞的钙稳态及其可能的NMDA受体机制。本实验研究将为探讨载脂蛋白E参与AD发病的分子机制,进而制定相应的防治策略以阻止疾病进程、改善临床结局提供有益的线索。为此,实验分以下三部分进行。第一部分:载脂蛋白E对大鼠海马CA1区在体LTP的影响本实验通过急性侧脑室内注射重组人apoE4和apoE3并记录海马场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential,fEPSP）,观察了不同亚型载脂蛋白E对大鼠海马CA1区在体LTP的作用及其可能的NMDA受体机制。实验采用Wistar大鼠,麻醉后将其固定在脑立体定位仪上,分别将脑室套管和捆绑的同心圆双极刺激电极和单极记录电极,精确插入到侧脑室或海马刺激与记录部位。通过给予海马schaffer侧枝单个电刺激、强直电刺激和双脉冲刺激,在海马CA1区放射层诱发和记录基础的fEPSP、强直刺激引起的fEPSP的长时程增强即LTP、以及配对脉冲引起的双脉冲易化（paired pulse facilitation,PPF）。经脑室套管向侧脑室内注射重组人apoE4或apoE3,或/和腹腔内注射NMDA受体非竞争性拮抗剂MK801,观察各种药物对基础fEPSP、LTP以及PPF的影响。结果显示:（1）脑室内apoE4和apoE3的预处理均不影响基础性突触传递。（2） apoE4预处理以剂量和时间依赖的方式对高频电刺激引起的海马在体LTP具有显著的抑制作用。给予HSF后1min、30min、60min,对照组fEPSPs幅度分别增强至210.0±10.7%、167.7±5.9%和165.4±5.1%;0.5μg apoE4预处理30min并给与HFS后,fEPSPs幅度分别降至192.1±8.6%、147.7±3.9%和145.6±3.9%（P＜0.01）;1μg apoE4预处理使fEPSPs幅度分别降至172.1±2.0%、129.3±5.1%和121.1±3.9%（P＜0.001）;2μg apoE4预处理使fEPSPs幅度分别进一步降至151.8±3.9%、108.0±4.3%和103.5±3.8%（P＜0.001）。同样使用1μg apoE4,随着预处理时间的延长,其对LTP的抑制作用也逐渐增强,在HSF后60min时,10min、30min和60min预处理组LTP值分别为142.5±4.3%、121.1±3.9%和101.0±2.6%（P＜0.01）。（3）与apoE4作用不同,apoE3对海马在体LTP未呈现明显影响。1μg apoE3预处理60min时,HFS后1min、30min和60min的fEPSPs幅度分别为211.6±8.8%、161.1±8.8%和159.5±6.7%（P＞0.05）。（4） apoE4预处理未影响PPF。（5） MK801单独作用显著抑制了海马在体LTP,但当与apoE4合用时并未进一步增强apoE4对LTP的压抑作用。1μg apoE4预处理60min,在HSF后1min、30min和60min时,LTP值分别为151.1±4.7%、107.5±5.1%和101.0±2.6%;apoE4与MK80l（0.1mg/kg,i.p.）共同给药组LTP值分别为146.2±2.3%、108.1±3.9%、100.8±3.1%,与单独给予apoE4比较,两组间没有显著性差异（P＞0.05）。该结果提示,载脂蛋白E对海马在体LTP发挥了亚型特异性作用,其中apoE4具有伤害LTP诱导的作用。而且,载脂蛋白E4对海马在体LTP诱导的抑制作用可能不是通过影响突触前递质的释放,而是通过损害突触后NMDA受体的功能发挥作用的。第二部分:载脂蛋白E对急性分离的大鼠海马神经元和培养的大鼠皮层神经元NMDA电流的影响本实验采用全细胞膜片钳技术观察了不同亚型载脂蛋白E（apoE4,apoE3）对急性分离的大鼠海马神经元和原代培养的大鼠皮层神经元NMDA电流的影响。大鼠海马CA1区神经元取自10～12天的Wistar大鼠,通过酶解和机械吹打急性分离而得;培养的原代皮层神经元来自新生的Wistar乳鼠,急性分离后常规培养,于接种后3天加阿糖胞苷以抑制胶质细胞的增殖,培养10～14天后成熟的皮层神经元用于膜片钳实验。膜片钳实验使用Axopatch 200B放大器和Digidata 1200B转换器,采用全细胞记录模式,钳制电位设定为-70mV,在Pclamp8.0界面下操作记录。硼硅玻璃记录电极用两步微电极拉制仪（PP-830）拉制,最终电极阻抗为5～7MQ。细胞外液采用无镁且加有甘氨酸的Tyrode平衡盐溶液,细胞内液主要成分为K+-Gluconate。给药装置为多管快速重力灌流系统,将apoE4、apoE3、NMDA等药物直接作用于细胞体上,从而观察不同亚型载脂蛋白E对NMDA配体门控通道电流的影响。结果可见,生理相关浓度的重组人apoE4（100nM）预处理可快速而显著地增强急性分离的大鼠海马神经元和原代培养的大鼠皮层神经元上记录的NMDA配体门控电流。在急性分离的海马神经元,100nM apoE4预处理10s和30s使NMDA电流分别增加至126.9±3.9%和161.7±4.6%（P＜0.01）;在原代培养的皮层神经元,100nM apoE4预处理30s和60s使NMDA电流分别增加至144.2±14.0%、170.3±13.9%（P＜0.01）。相反,同样浓度的重组人apoE3对NMDA电流则无明显影响。在急性分离的海马神经元和原代培养的皮层神经元,100nM apoE3预处理60s,其NMDA电流分别为104.0±8.8%和107.9±9.8%（P＞0.05）。这表明,载脂蛋白E对海马和皮层神经元NMDA受体功能活动发挥了亚型特异性作用,apoE4具有快速上调NMDA受体功能的效应。这种由apoE4产生的NMDA受体病理性激活,有可能使胞内钙水平过度升高,并与apoE4的神经毒性作用和AD的发病过程密切相关。此外,生理相关浓度的apoE4即可引起NMDA电流的明显增强,说明NMDA受体是载脂蛋白E4的又一敏感的作用靶点。第三部分:载脂蛋白E对原代大鼠皮层神经元胞内钙稳态的影响本实验采用激光共聚焦钙离子荧光成像技术观察了不同亚型载脂蛋白E（apoE4,apoE3）对原代培养的大鼠皮层神经元胞内静息钙水平和NMDA诱发钙反应的影响。培养的原代皮层神经元来自新生的Wistar乳鼠,酶机械法分离后常规培养,于接种后3天加阿糖胞苷以抑制胶质细胞的增殖,培养10天后取成熟的皮层神经元用于荧光钙测定。荧光染料选Fluo-3/AM,对皮层神经元有效负载后在激光共聚焦荧光显微镜下观察并记录其胞内静息钙水平或其变化,激发波长488nm,发射波长526nm。为了捕捉胞内钙的快速变化,信号采集间隔设为2ms。根据药物作用时间将实验分为急性和慢性两部分。在急性实验部分,培养10天的皮层神经元洗去培养基,负载染料,先记录1min的胞内静息钙水平。然后,分别给予不同浓度的重组人apoE4、apoE3和MK801,动态观察胞内钙水平的变化20min。最后给予100μM NMDA,继续观察1min以了解皮层神经元对NMDA的钙反应。在慢性实验部分,皮层神经元培养8天后进行药物干预,作用48小时,洗去培养基,负载染料,观察胞内静息钙水平1min;然后给予100μM NMDA,观察皮层神经元NMDA钙反应1min。结果显示:（1）急性给予apoE4剂量依赖性和时间依赖性升高了细胞内的钙水平。100nM和300nM apoE4给药后20min,神经元胞浆相对钙荧光强度升高到137.7±6.9%和154.1±7.6%,与对照组（100.4±8.1%）相比具有显著性差异（P＜0.01）;同样浓度（300nM）的apoE4在给药后5min、10min和20min不同时间点,其相对荧光强度分别升高到118.4±7.7%、138.2±8.0%和154.1±7.6%,存在显著差异（P＜0.01）。（2）急性给予apoE4引起的胞内钙水平增高可以被NMDA受体非竞争性拮抗剂MK801部分阻断。急性给予100nM apoE4引起的[Ca2+]i升高（137.7±6.9%）被MK801降至120.7±8.4%（P＜0.05）。（3）急性给予apoE4同样显著性增强了NMDA诱发的钙反应。对照组NMDA诱发的钙升高为317.9±8.6%,急性给予100nM和300nMapoE4使NMDA（100μM）诱发的钙反应增加至335.8±9.7%和360.8±8.4%（P＜0.05）。（4）慢性apoE4预处理也显著升高了胞内钙水平,并且也被MK801有效阻断。100nM和300nm apoE4作用48小时后[Ca2+]i显著升高到172.5±6.4%和201.2±9.3%（P＜0.01）;MK801则使100nMapoE4引起的[Ca2+]i升高降至131.0±7.1%（P＜0.01）。但慢性apoE4预处理却使NMDA引起的钙反应明显降低。100nM和300nm apoE4作用48小时,使NMDA引起的钙反应峰值从对照组的317.9±8.6%分别降至200.8±9.7%和154.8±8.4%（P＜0.01）。（5）即使在高浓度下（300nM）,急性、慢性apoE3处理均未引起细胞内静息钙水平及NMDA钙反应的显著改变。钙成像实验结果提示,即使在生理浓度下,载脂蛋白E4也可通过激活NMDA受体从而扰乱神经元胞内钙稳态。由此导致的细胞内钙超载可能是AD发病早期的关键事件,据此设计特异性NMDA受体阻断剂将有可能成为保护神经元免受apoE4伤害的有效治疗策略之一。综合以上实验,本研究通过使用场电位记录、全细胞膜片钳记录等电生理技术和激光共聚焦钙离子荧光成像技术,观察了载脂蛋白E不同亚型（apoE4,apoE3）对大鼠海马在体LTP、急性分离的大鼠海马神经元和培养的大鼠皮层神经元NMDA配体门控通道电流、原代大鼠皮层神经元胞内静息钙水平及NMDA钙反应等的影响;同时,对NMDA受体在apoE4引起的LTP压抑和钙信号改变中的作用机制进行了探讨。证实了载脂蛋白E对上述指标具有亚型特异性作用,apoE4而非apoE3对海马LTP、NMDA受体通道电流以及细胞内钙稳态均呈现了明显的伤害效应。这些结果不仅有助于解释apoE4神经毒性作用的细胞和分子机制,也将为AD的有效治疗提供新的思路。
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