拟南芥CBL和CIPK参与冷胁迫信号通路的研究

论文摘要

低温是影响植物生长发育的重要逆境因子之一,对植物抗冷/冻性的研究是植物逆境胁迫研究的热点之一。低温胁迫会引起植物细胞中Ca2+浓度短暂的迅速升高,起始植物对低温胁迫的钙信号系统。在钙信号系统中,钙传感蛋白是细胞内最先感知Ca2+变化的钙离子结合蛋白,对低温胁迫下钙信号的传递与转导非常重要。钙调神经磷酸酶B亚基类似蛋白（Calcineurin B-like proteins, CBLs）家族是植物细胞中一类独特的钙传感蛋白。CBL蛋白通过与CBL相互作用蛋白激酶（CBL-interacting protein kinases, CIPKs）结合,将钙信号向下游传递。大量研究表明,CBL-CIPK复合体介导了植物对多种外界刺激的信息传递,参与调控植物细胞对逆境胁迫的应答。然而,对于CBL-CIPK复合体参与植物低温胁迫应答的研究还较少。本论文以模式植物拟南芥为研究对象,利用分子生物学和生理学研究手段,对4℃冷胁迫下CBL1钙传感蛋白和CIPK7蛋白激酶进行了调查和研究,为植物细胞如何特异地感知并传递低温信号的研究提供了理论依据,取得了以下研究结果：1.克隆得到拟南芥CIPK7和CBL1基因,并且发现它们的表达与冷胁迫相关。应用荧光定量PCR分析了4℃冷胁迫下,拟南芥CIPK7和CBL1基因的表达,发现3周龄拟南芥叶片中CIPK7和CBL1基因的表达都受冷胁迫诱导。2.通过体外及半体内实验阐明CIPK7和CBL1蛋白之间的相互作用。GSTpull-down实验结果显示,CIPK7与CBL1蛋白存在体外相互作用；通过亲合纯化的方法,用体外表达的GST-CBL1蛋白从拟南芥叶片蛋白提取物中可以亲合纯化得到CIPK7蛋白,说明CIPK7与CBL1存在半体内相互作用。CIPK7和CBL1蛋白之间的体外及半体内相互作用,暗示CIPK7与CBL1蛋白可能存在体内的相互作用。3.通过对cbl1突变体与野生型植株的比较研究,揭示了CBL1参与拟南芥对冷胁迫应答的信号通路。在冷胁迫处理下,cbl1突变体与野生型植株虽然不存在存活率的差异,但是电解质渗漏率和脯氨酸含量的测定结果显示,与野生型植株相比,cbl1突变体对冷胁迫更加敏感。进一步地,通过实时监测冷胁迫下cbl1突变体与野生型植株冷胁迫响应基因的表达模式,发现cbl1突变体冷胁迫响应基因的表达模式发生改变,说明CBL1基因的功能缺失导致冷胁迫响应信号通路发生改变,CBL1参与拟南芥对冷胁迫应答的信号通路。4.利用荧光定量PCR和Western blot免疫印迹分析,揭示CBL1基因的功能缺失对CIPK7受冷胁迫诱导表达具有一定作用。本论文应用荧光定量PCR和Western blot免疫印迹方法,比较了在cbl1突变体和野生型植株中,冷胁迫对CIPK7基因以及蛋白表达的诱导。荧光定量PCR的实验数据显示,与野生型植株相比,在cbl1突变体中,CIPK7基因受冷胁迫诱导表达有所延迟,诱导表达的幅度减弱；Western blot免疫印迹分析的结果与荧光定量PCR的结果相吻合,验证了CBL1基因的功能缺失对CIPK7受冷胁迫的诱导表达有影响。以上研究结果表明,在拟南芥中,CIPK7的表达受冷胁迫诱导,CIPK7蛋白与CBL1蛋白存在相互作用。CBL1的表达也受冷胁迫诱导,并且CBL1参与介导了拟南芥对冷胁迫应答的信号通路。我们通过对CIPK7在野生型植株与cbl1突变体中受冷诱导表达模式的比较,认为CIPK7可能通过与CBL1的相互作用,在拟南芥对冷胁迫的应答中发挥一定作用。本研究为进一步阐明低温胁迫下CBL和CIPK蛋白复合体在信号转导方面的功能奠定了理论基础,为揭示植物响应低温逆境的冷适应机制提供了科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 植物耐受低温胁迫的研究进展
• 1.1.1 低温胁迫对植物的影响
• 1.1.2 植物抗冷/冻机理
• 1.2 低温胁迫下植物钙信号转导的分子机制研究现状
• 1.2.1 低温胁迫下钙信号的产生
• 1.2.2 植物细胞钙离子结合蛋白及钙信号通路在植物对低温胁迫的应答
• 1.3 CBL-CIPK
• 1.3.1 小分子钙离子结合蛋白CBL
• 1.3.2 CBL特异性相互作用蛋白激酶CIPK
• 1.3.3 CBL-CIPK复合体参与各种逆境胁迫的信号转导
• 1.4 立题依据
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 微生物材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 CIPK7和CBL1基因克隆
• 2.2.2 半定量RT-PCR
• 2.2.3 原核表达载体构建
• 2.2.4 融合蛋白的诱导表达与纯化
• 2.2.5 CIPK7、CBL1蛋白特异性多克隆抗体的制备与纯化
• 2.2.6 GST pull-down实验
• 2.2.7 亲合层析纯化
• 2.2.8 cbl1纯合突变体的鉴定
• 2.2.9 电解质渗漏率测定
• 2.2.10 脯氨酸含量测定
• 2.2.11 Real-time荧光定量PCR分析
• 2.2.12 Western blot免疫印迹分析
• 2.2.13 可溶性糖含量测定
• 第三章 实验结男
• 3.1 低温胁迫诱导拟南芥CIPK7基因的表达
• 3.1.1 CIPK7基因的克隆
• 3.1.2 CIPK7基因的组织特异性分布
• 3.1.3 低温诱导CIPK7基因的表达
• 3.2 CIPK7和CBL1融合蛋白的原核表达纯化与抗体制备
• 3.2.1 GST-CBL1、GST-CIPK7和CBL1-His原核表达载体构建
• 3.2.2 GST-CBL1、GST-CIPK7和CBL1-His融合蛋白的诱导表达与纯化
• 3.2.3 CBL1和CIPK7蛋白多克隆抗体的制备和效价检测
• 3.3 CIPK7与CBL1蛋白的相互作用
• 3.3.1 CIPK7与CBL1蛋白的体外相互作用
• 3.3.2 CIPK7与CBL1蛋白的半体内相互作用
• 3.4 CBL1参与冷胁迫信号通路的调控
• 3.4.1 CBL1基因受冷胁迫诱导表达
• 3.4.2 cbl1纯合突变体的鉴定
• 3.4.3 cbl1突变体对冷胁迫更敏感
• 3.4.4 cbl1突变体中冷胁迫响应基因表达模式改变
• 3.5 CIPK7参与冷胁迫信号通路
• 3.5.1 CIPK7基因在野生型和cbl1突变体中受冷胁迫的诱导表达
• 3.5.2 CIPK7蛋白在野生型和cbl1突变体中受冷胁迫的诱导表达
• 3.5.3 可溶性总糖含量测定
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 在读期间发表论文情况
• 致谢