未培养细菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及酶学性质的初步研究

论文摘要

β—葡萄糖苷酶是纤维素酶系中的一种，是纤维素降解的限速酶。因此，通过构建基因工程菌以促进β—葡萄糖苷酶的表达，是实现纤维素高效降解的有用途径。构建未培养细菌的宏基因组文库是新兴的筛选新型基因的有效方法。在本研究中，我们采用β—葡萄糖苷酶活性筛选策略，从未培养碱性污染物宏基因组AL01文库中筛选到3个编号分别为pGXAG142、pGXAG313和pGXAG805的阳性克隆。对它们进行DNA测序后进行了生物信息学分析。结果显示，这3个克隆的外源片段分别包含有783 bp、510 bp和1443bp的ORF，分别编码281、170、481个氨基酸组成的蛋白质，pI／Mw分别为4.88／29079.25kDa、6.28／18513.32 kDa、5.16／57383.4 kDa。BLAST软件分析这3个基因与现有数据库中的β—葡萄糖苷酶基因没有任何DNA或者氨基酸水平的同源性，可能是新型的β—葡萄糖苷酶编码基因。PCR扩增这3个基因的ORF后将它们分别亚克隆到表达载体pETBlue-2上，然后转化至E．Coli Rosetta（DE3）plysS，平板酶活检测显示它们仍能降解底物，说明均携带了正确的读码框架。我们以大肠杆菌表达菌株pGXAG142G／Rosetta（DE3）plysS的表达蛋白Bglg142为主要研究对象，对其进行了酶学性质的初步研究，发现该酶的最适pH为5.5-8.0，最佳作用温度为50℃，Km值为0.238 mmol·L-1，Vmax为10.6 U·min-1，最适条件下酶活为24.8 U·ml1。K+、Mg2+、Zn2+对酶反应有激活作用，Ca2+、Co2+、Cu2+、Ba2+则抑制酶活。HPLC产物分析结果确证Bglg142编码蛋白为β—葡萄糖苷酶。本研究所阐述的3个新型β—葡萄糖苷酶是采用未培养方法获取的，为该方法发现新基因的有效性提供了又一个有力的依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 未培养微生物研究概况及其发展前景
• 1.1.1 未培养微生物发展概况
• 1.1.2 未培养微生物的发展前景
• 1.2 β-葡萄糖苷酶简介及研究概况
• 1.2.1 β-葡萄糖苷酶简介
• 1.2.2 β-葡萄糖苷酶研究概况
• 1.2.2.1 β-葡萄糖苷酶作用机理的研究
• 1.2.2.2 β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达
• 1.2.2.3 关于β—葡萄糖苷酶的酶学性质研究
• 1.2.2.4 β-葡萄糖苷酶的固定化研究
• 1.2.2.5 β-葡萄糖苷酶研究的理论和应用意义
• 1.3 展望
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 培养基、生长条件及常用抗生素
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 培养条件
• 2.2.3 菌种保存
• 2.2.4 抗菌素
• 2.3 溶液、缓冲液和试剂
• 2.4 所用仪器
• 2.5 质粒DNA的制备
• 2.5.1 碱变性法小量提取质粒DNA
• 2.5.2 大量制备质粒DNA
• 2.5.3 试剂盒提取质粒
• 2.5.3.1 试剂盒小量提取质粒
• 2.5.3.2 试剂盒大量提取质粒
• 2.6 质粒DNA的纯化、定量与沉淀
• 2.6.1 质粒DNA的沉淀与贮存
• 2.6.2 分光光度法测定DNA浓度
• 2.7 琼脂糖凝胶电泳
• 2.8 DNA酶切
• 2.8.1 DNA的限制性内切酶酶切
• 2.8.2 DNA酶切片段的分离与回收
• 2.8.2.1 从低熔点胶中回收DNA片段
• 2.8.2.2 试剂盒法回收DNA片段
• 2.9 DNA的连接
• 2.9.1 载体质粒DNA的去磷酸化处理
• 2.9.2 DNA的连接
• 2.10 质粒DNA的转化
• 2.10.1 E.coli感受态细胞的快速制备及质粒DNA的电脉冲导入
• 2.10.2 PCR扩增DNA片段
• 2.11 基因的表达与检测
• 2.11.1 所用溶液
• 2.11.2 蛋白质样品的制备
• 2.11.3 SDS-PAGE蛋白质电泳
• 2.11.4 亲和层析纯化目标蛋白
• 2.11.5 蛋白质浓度标准曲线的绘制
• 2.11.6 pNPG法测定β-葡萄糖苷酶的酶活
• 第三章 β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆及序列分析
• 3.1 碱性土壤宏基因组DNA文库AL01中β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆及验证
• 3.1.1 碱性土壤宏基因组DNA文库AL01中β-葡萄糖苷酶基因的活性筛选
• 3.1.2 β-葡萄糖苷酶基因的验证
• 3.2 β-葡萄糖苷酶基因序列分析结果
• 3.2.1 pGXAG142的序列测定及其序列分析结果
• 3.2.1.1 pGXAG142的序列测定
• 3.2.1.2 pGXAG142的序列分析
• 3.2.2 pGXAG313的序列测定及其序列分析结果
• 3.2.2.1 pGXAG313的序列测定
• 3.2.2.2 pGXAG313序列分析
• 3.2.3 pGXAG805的序列测定及其序列分析结果
• 3.2.3.1 pGXAG805的序列测定
• 3.2.3.2 pGXAG805序列分析
• 3.2.4 系统进化树的构建
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达
• 4.1 PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因
• 4.2 β-葡萄糖苷酶基因重组质粒的构建及表达
• 4.2.1 pGXAG142G重组质粒的构建及表达
• 4.2.1.1 pGXAG142G重组质粒的构建
• 4.2.1.2 pGXAG142G/Rosetta（DE3）plysS在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.2.1.3 Pgxag142g目标蛋白的纯化
• 4.2.2 pGXAG313G的表达载体的构建及表达
• 4.2.2.1 pGXAG313G的表达载体的构建
• 4.2.2.2 pGXAG313G/Rosetta（DE3）plysS在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.2.2.3 Pgxag313g目标蛋白的纯化
• 4.2.3 pGXAG805G的重组质粒的构建及表达
• 4.2.3.1 pGXAG805G重组质粒的构建及验证
• 4.2.3.2 pGXAG805G/Rosetta（DE3）plysS在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.3 Pgxag142g的酶学特性分析
• 4.4 HPLC产物分析
• 4.5 结论
• 4.6 讨论
• 第五章 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间所发表的论文与研究成果